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蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出,指由一个基因组(Genome),或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(protein)。 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别,它随着组织、甚至环境状态的不同而改变。在转录时,一个基因可以多种mRNA形式剪接,一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物,蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目。蛋白质组学(Proteomics)处于早期“发育”状态,这个领域的专家否认它是单纯的方法学,就像基因组学一样,不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系,而是一个领域。 蛋白质的研究内容 1、结构蛋白质组学: 主要是蛋白质表达模型的研究,包括蛋白质氨基酸序列、分析及空间结构的解析种类分析及数量确定; 2、功能蛋白质组学: 主要是蛋白质功能模式的研究,包括蛋白质功能及蛋白质间的相互作用。 蛋白质组学的领域 1、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰; 2、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比较; 3、应用特定的分析技术如质谱法(包括串联质谱法、生物质谱法)或酵母双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。 蛋白质组学的研究技术 1、蛋白质分离技术双向凝胶电泳(2DE),双向荧光差异电泳(2D-DIGE),等电聚焦电泳(IEF),液相色谱。 多维色谱(MDC),多维液相色谱(MDLC)。 2、蛋白质鉴定技术一级质谱:根据离子源的不同,分为基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾质谱(ESI- MS)。 二级质谱:肽质量指纹图谱(PMF)。 新技术:稳定同位素特征标签生物质谱(SIAMS) ![]() 多维色谱法,包括大小排阻色谱法、离子交换色谱法、反相高效色谱法、疏水性相互作用色谱法等; 多维电泳技术,包括二维凝胶电泳法、自由流动电泳法、毛细管区带电泳法等; 亲合法,包括免疫印迹法、亲和捕获; 细胞器,膜的复合体分离。 二维凝胶电泳法 二维凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。 2-DE有较好的分辨率,SDS-PAGE或单相IEF的最好分辨率仅为100个蛋白,而2-DE大约为3000个蛋白。蛋白质肽段的鉴定 氨基和羧基末端分析,如:Edman; 质谱法,包括肽片段的质谱和串联质谱法。 质谱法 质谱(mass spectrum)是化合物分子在真空条件下受电子流的轰击或强电场等其他方法的作用,电离成离子,同时发生某些化学键有规律的断裂,生成具有不同质量的带电荷的离子,这些离子按质荷比m/z(离子的质量m与其所带电荷z的比值)的大小被收集并记录程谱的方法。 生物质谱技术是蛋白质组学研究中最重要的鉴定技术,其基本原理是样品分子离子化后,根据不同离子之间的荷质比(M/E)的差异来分离并确定分子量。对于经过双向电泳分离的目标蛋白质用胰蛋白酶酶解(水解Lys或Arg的-C端形成的肽键)成肽段,对这些肽段用质谱进行鉴定与分析。目前常用的质谱包括两种:基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾质谱(ESI- MS)。蛋白质相互作用 技术 原理 优点 缺点 酵母双杂交系统 当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后,诱饵蛋白结合于报道基因的启动子,启动报道基因在酵母细胞内的表达,如果检测到报道基因的表达产物,则说明两者之间有相互作用,反之则两者之间没有相互作用。 蛋白质有可能保持天然的折叠状态,敏感度高,简捷 假阳性;融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录 噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA 序列,当噬菌体生长时,表面就表达出相应的单抗,再将噬菌体过柱,柱上若含目的蛋白,就会与相应抗体特异性结合 高通量,简便,直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合 须经过细菌转化、噬菌体包装;文库中分子遗传的多样性有局限性,有些序列不能表达,对细胞有毒性的分子不能表达和展示 Pull down 技术 将靶蛋白-GST/his融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白 可从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系,简单易行,操作方便 假阳性 免疫共沉淀 (CoIP) 以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法 蛋白处于天然状态,可以避免人为影响;可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体 不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白;灵敏度低 Far -Western (亲和印记) 将PAGE 胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用,最后显影 可检测不需要自然折叠状态的蛋白质之间的相互作用 转膜前需要将蛋白复性 等离子表面共振技术(Surface plasmon resonance,SPR) 利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”,当待测蛋白与诱饵蛋白结合后,薄膜的共振性质会发生改变,通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。 不需要标记物和染料,安全灵敏快速,还可定量分析 需要专门的等离子表面共振检测 仪器。 荧光共振能量转移技术(FRET) 指两个荧光法色基团在足够近( 可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子的构象变化,能够定性定量的检测相互作用的强度 此项技术要求发色基团的距离小于100 埃,设备昂贵,还需要融合GFP 给蛋白标记。 蛋白质芯片阵列技术 对固相载体进行特殊的化学处理,再将已知的蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等),根据这些生物分子的特性,捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等),经洗涤、纯化,再进行确认和生化分析 可直接用粗生物样品(血清、尿、体液)进行分析,可同时快速发现多个生物标记物,小量样品,高通量, 芯片制备复杂,蛋白质的非特异性结合,灵敏度和分辨率低 蛋白质组学的应用 疾病研究 植物学 药物研究 食品科学 遗传病学 微生物学 在疾病及药物研究中的应用 1、发现新的疾病标志物,鉴定疾病相关蛋白质作为早期临床诊断标志。 例如:Lei等通过2-DE和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱等蛋白质组学相关技术对膀胱癌患者的尿蛋白进行分离鉴定,获得14个差异表达的蛋白质,这些差异表达的蛋白可能是诊断和检测膀胱癌的潜在尿标志物。 2、探索疾病的发病机制和治疗途径 例:Polprasert等应用蛋白质组学方法对遗传性球形红细胞增多症的红细胞膜蛋白变化进行研究,分离鉴定出56个差异表达的蛋白质,通过蛋白质网络分析出包括细胞死亡、细胞循环及遗传性和血液性紊乱3个HS相关的重要网络,为进一步研究和了解HS相关的发病机制提供了参考。 3、研究膜蛋白及膜相关蛋白 Liu等利用比较膜蛋白组学方法对H5N1病毒分别感染6,12,14h的人肺腺癌细胞A549进行蛋白分析鉴定,得到24个差异表达的蛋白质,其中57%为膜蛋白或膜相关蛋白,通过siRNA技术鉴定出与病毒增殖相关的几种蛋白质。 4、为快速,特异,高通量的药物研究提供了技术支持 Lin等应用蛋白质组学技术对阿霉素处理的人子宫癌细胞的蛋白表达变化进行研究发现,有 37 种差异表达的蛋白质,为阿霉素抗性的子宫癌细胞的治疗提供了诊断和治疗标志物。 |
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