水蛭的DNA分子鉴定和蛋白质分析

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作者：

郑阳

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摘要：

水蛭为蚂蟥Whitmania pigra Whitman,水蛭Hirudo nipponica Whitman和柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体,具有破血通经,逐瘀消瘢之功效.在中药材市场上,水蛭的主要来源为蚂蟥(又称宽体金线蛭),另有少量的水蛭(又称日本医蛭),而柳叶蚂蟥(又称尖细金线蛭)较为罕见.随着近年来含水蛭中成药的不断开发,水蛭的需求量增加,已成为了紧俏中药材之一,市面上出现了以伪品菲牛蛭代替水蛭入药的情况.研究表明,伪品菲牛蛭和蚂蟥在发挥抗凝血活性时对凝血酶的作用机制以及抗凝血途径有一定区别,在临床上混用对患者用药安全与有效带来不良影响.传统的鉴定方法以水蛭的性状特征为依据,但在药材市场上,水蛭商品主要有清水吊干品,水蛭段和烫水蛭,在外形特征上与基原动物相比变化较大,很难准确鉴定;此外,蚂蟥作为中药水蛭的主要品种,其发挥抗凝血活性的物质基础和作用机制仍不明确.本论文研究依据正品水蛭及其常见伪品菲牛蛭的COI序列差异设计了物种特异性引物,并通过PCR建立水蛭的DNA分子鉴定技术,用于鉴定中药水蛭的真伪(掺伪);利用SDS-PAGE和2-DE分别对正品水蛭及其伪品基原动物的蛋白质进行分析,发现不同品种水蛭的电泳图谱中,存在稳定出现的蛋白质条带及斑点,可作为中药水蛭真伪鉴定的依据;选取不同品种水蛭的SDS-PAGE蛋白条带,对其胶内消化后所得的多肽片段混合物以MALDI-TOF-MS进行分析,鉴定所含有的蛋白质;此外,对蚂蟥中抗凝血活性蛋白质进行提取,以血浆复钙时间为活性指标,通过DEAE-52,Sephadex G-75和Sephadex LH-20对抗凝血蛋白质进行分离,并利用MALDI-TOF-MS进行鉴定.主要研究内容如下:(1)首先基于宽体金线蛭,尖细金线蛭,日本医蛭和菲牛蛭的COI序列基因差异设计筛选出3对特异性引物,提取不同品种水蛭的DNA,并对退火温度进行优化,确定最适的PCR扩增程序;然后对引物的特异性,灵敏度和适用性进行考察,最后将所建立的特异性引物扩增技术应用于市售水蛭商品的检测.结果表明,设计筛选得到的3对引物专属性强,其中宽体金线蛭和尖细金线蛭共用一对引物,目的产物长度为63 bp;日本医蛭和菲牛蛭的目的扩增产物长度分别为102 bp和75 bp.3对引物的特异性良好,彼此之间无交叉反应,且具有较高的灵敏度,同时还能用于鉴别掺伪品.此外,对水蛭市售商品的检测结果显示,19批次水輕中有12批次被鉴定为正品,6批次为伪品,还有1批次为掺伪品.(2)超声提取不同品种水蛭中的蛋白质,然后分别利用SDS-PAGE和2-DE进行分析.在SDS-PAGE图谱中,宽体金线蛭有10条稳定出现的蛋白条带;日本医蛭中有9条;菲牛蛭中有13条稳定出现的蛋白条带,数量最多.由2-DE结果可知,宽体金线蛭中蛋白点主要分布在45 kD以下,其中有25个稳定出现的蛋白点;日本医蛭中的蛋白质分布比较集中,主要位于pH3-8和分子量小于66.2 kD的区域内,碱性端还有一个稳定出现的蛋白点;菲牛蛭中的蛋白质则主要分布在三个区域,分别是位于酸性端且分子量小于25 kD的区域Ⅰ,位于中性部分且分子量小于45 kD的区域Ⅱ以及靠近碱性端且分子量不超过14.4 kD的区域Ⅲ,还有一个位于碱性端且分子量约为25 kD的蛋白点.不同品种水蛭基原动物的SDS-PAGE和2-DE图谱之间有明显差异,利用物种中稳定存在的蛋白质条带(斑点)作为依据能够区分不同品种的水蛭.同时,对市售水蛭商品中蛋白质的分析表明,水蛭药材和生品与基原动物相似,SDS-PAGE和2-DE图谱中稳定出现的蛋白质条带(斑点)可以作为鉴定依据判别真伪;而大部分水蛭炮制品中蛋白质条带(斑点)的数量较少,个别样品中甚至无蛋白质条带出现.(3)选取宽体金线蛭,日本医蛭和菲牛蛭SDS-PAGE分离得到的蛋白质条带,对其胶内消化后所得的多肽片段混合物以MALDI-TOF-MS进行分析.从宽体金线蛭中鉴定出3个可信度较高的蛋白质,其中分子量约为39kD的条带Ⅳ中鉴定出heat-inducible transcriptional repressor HrcA,来源于Rhizobium sp.R339;分子量约为28 kD的条带V中鉴定出DNA-binding response regulator,来源于Bacillus sp.FJAT-26390;分子量约为16.4 kD的条带Ⅷ中鉴定出glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,来源于Hassallia byssoidea VB512170.同时,日本医蛭中仅条带Ⅳ(分子量约为23kD)中鉴定出了 1个可信度较高的蛋白质,为来源于Nematostella vectensis的predicted protein.此外,从菲牛蛭条带Ⅱ(分子量约为47 kD)和条带V(分子量约为20 kD)中鉴定了来源于Bubalus bubalis的serum albumin和 Paraburkholderia soli的 NAD-glutamate dehydrogenase.(4)将蚂蟥用石油醚脱脂后采用水煎煮法提取抗凝血活性蛋白质;以血浆复钙时间为追踪指标,利用DEAE-52离子交换层析,Sephadex G-75和Sephadex LH-20分子筛层析对活性蛋白质进行分离.结果表明,蚂蟥的水提物具有良好的抗凝活性;且从中分离纯化得到了一种电泳纯的活性蛋白质/多肽,经MALDI-TOF-MS分析,鉴定为来源于Comamonas testosteroni的hypothetical protein.

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学位级别：

硕士