ImageJ实用技巧

免疫荧光染色是研究特异蛋白抗原在细胞内分布的一种常用实验技术，通过荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下对抗原进行细胞定位。

但免疫荧光的照片不仅仅可以做形态学分析，还能通过检测平均荧光强度，对特异性蛋白表达进行半定量分析。

在进行平均荧光强度检测之前，首先要清楚平均荧光强度的定义。

对于一张单通道（单色）的荧光图片，每个像素的灰度值代表了该点的荧光强度大小，特定区域的荧光强度公式：

平均荧光强度(Mean) = 该区域荧光强度总和(IntDen) / 该区域面积(Area)

Mean: Mean gray value

IntDen: Integrated Density

下面是一张激光共聚焦显微镜拍的荧光照片，通过这个实例介绍一下，怎么利用ImageJ进行平均荧光强度的检测。

以下图为例：

1、加开图像后，提取出单一通道（Image-Color-Split Channels）

如果图像储存时为RGB格式，需要先分割出该通道：

如果图像是16-bit或者8-bit，可以直接进行Threshold操作。

2、调整阈值，选择适当的区域（Image-Adjust-Threshold）

软件会自动选取一个默认值，统一选取默认值（为了消除不同照片，因为手动选取阈值造成的误差，最好使用默认的阈值）。

注意：

另外，不同Threshold算法会带来不同的结果，如果默认算法（Default）设定的阈值不符合要求，需要重新选择算法。

3、选择合适阈值算法（Image-Adjust-Auto Threshold）

这里选择Try all，点击OK后会列出所有算法设定的阈值：

根据结果判断，这里选择Default算法即可。

4、设定需要测量的参数（Analyze-Set Measurements）

确认勾选Mean gray value和Limit to threshold（十分重要），点击OK。如果没有勾选Limit to threshold，则测量的是整张图片的平均荧光强度。

6、检测（Analyze-Measure）

点击Measure后弹出检测结果：

Mean即为平均荧光强度。（Mean即Mean gray value，等于IntDen/Area），IntDen=Integrated Density（荧光强度总和）

可以将结果复制到Excel或者直接导出生成csv文件（Results窗口-File-Save as）

这样我们就得出了图片的平均荧光强度，但需要注意的是：免疫荧光是半定量分析，平均荧光强度只能半定量地表征特异性蛋白的表达。

主要是因为免疫荧光实验中的人为因素太多，例如拍照时的曝光、焦距等等，而且非特异性结合的因素也不能完全消除。所以我们在拍照的时候，以及处理数据的时候，一定要有一个固定的标准和流程，从而减小误差。

注意：平均荧光强度并不等于免疫组化中的光密度（Optical Density），所以不需要Invert以及Calibration。单位可以用Arbitrary Units（AU）。