新型自组装多肽水凝胶对成骨细胞前体细胞作用的体外研究

目前临床上应用的合成骨替代材料，如羟基磷灰石、陶瓷材料等，存在不利于细胞粘附以及生物相容性差等缺点[1]。为了解决上述的问题，需要新的材料来对其表面进行修饰或是替换，水凝胶材料是很好的选择。RADA16-Ⅰ由16肽氨基酸组成，是自组装多肽水凝胶的代表，其能在水相离子或生理盐溶液触发下，分子水平组装成β折叠，并往复形成互补离子键，最终组装成纳米纤维，其纤维直径10～20 nm，孔径5～200 nm，含水量大于99%[2, 3, 4]。研究表明，水凝胶结构能够模拟细胞外基质(extracellular matrix，ECM)及其微环境，为细胞提供良好的体外生长环境，有利于细胞的粘附、增殖和分化[5]；但是，目前作为支架材料的水凝胶缺乏促进成骨分化的能力。Osteostatin(Thr-Arg-Ser-Ala-Trp)是甲状旁腺类激素相关蛋白(PTHrP)C末端结构域PTHrP(107～111)五肽片段，能够介导PTH/PTHrP受体非相关性受体，在体外促进成骨细胞生长和分化[6, 7, 8]。此外，Osteostatin在骨缺损兔体内能促进骨再生[9, 10]。本研究通过利用Osteostatin片段对传统RADA16-Ⅰ进行修饰，期望得到兼顾粘附和促成骨相关性能的自组装多肽纳米水凝胶材料。

MC3T3-E1 Subclone 14小鼠成骨细胞前体细胞(ATCC)，多肽RADA16-Ⅰ(AcN-RADARADARADA-RADA-CONH2，相对分子质量为1 671.76)、RADA16/TRSAW(相对分子质量为2 387.54)和TRASW(相对分子质量为619.58)购自上海强耀生物科技有限公司(纯度≥99%)，α-MEM培养基，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-0.04% EDTA (Gibco公司)，14 mm圆形盖玻片(NEST公司)，CCK-8检测试剂盒(同仁公司)，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)检测试剂盒(南京建成)，茜素红-S(Sigma公司)，罗丹明鬼笔环肽(Sigma公司)，DAPI(碧云天公司)，反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)。

将Osteostatin与 RADA16-Ⅰ C末端相连，合成自组装多肽RADA16-TRSAW (AcN-RADARADARADARADA-GG-TRSAW-CONH2) 肽粉。自组装多肽母液的制备向肽粉(每10 毫克分装)内加入1 mL无菌超纯水，移液枪吹打混匀后，超声波清洗机室温超声处理30 min去除溶液粘性，得到1%(质量体积分数)的多肽母液。取RADA16-Ⅰ和RADA16-TRSAW母液等体积混合，得到1%(质量体积分数)TRSAWmx母液。

用超纯水分别稀释TRSAW、RADA16-Ⅰ、RADA16-TRSAW和TRSAWmx母液，得到0.5‰(质量体积分数)的稀释液，超声波清洗机室温超声处理30 min。取不同多肽稀释液各5 μL分别滴加到清洁的圆形云母片上，静置15 s后，用100 μL超纯水沿液滴边缘冲洗3次。30 ℃室温静置，待云母片自然干燥 后，AFM进行观察。AFM参数设置为轻敲模式，扫描区域为2 μm×2 μm，扫描频率是1.0 Hz；扫描探针(Model：Arrow UHFAuD)参数：弹性系数(k)为6(1.5～21.0)N/m，材质Si，无涂层，尖端半径为(10±2)nm。

分别将1%(质量体积分数)RADA16-Ⅰ和TRSAWmx母液与20%(质量体积分数)无菌蔗糖溶液按体积比1 ∶1混合，制成0.5%水凝胶工作液。取14 mm 圆形清洁盖玻片置于24孔培养板内，向每张盖玻片上分别滴加100 μL工作液。沿每孔内壁，缓慢加入含10%胎牛血清+1%双抗+50 μg/mL抗败血酸+ 10 mmol/L β-甘油磷酸钠的α-MEM成骨培养液，培养板置于37 ℃、5%CO2的孵箱中静置1 h。MC3T3-E1细胞常规消化离心后，成骨培养液制成5×104个/mL的单细胞悬液，待凝胶固化成型后，吸净孔内培养基，每孔接种1 mL MC3T3-E1细胞悬液于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，隔天换液。

分别向24孔板中放入14 mm圆形盖玻片，并滴加RADA16-Ⅰ和TRSAWmx工作液并使其成胶。在空白盖玻片、RADA16-Ⅰ水凝胶、TRSAWmx水凝胶上滴加1 mL MC3T3-E1细胞悬液，分别在第10、30、60、90分钟吸净孔内培养基，PBS清洗1次，以除去未粘附的细胞，随机选取视野对细胞进行计数。

在96孔板内，滴加RADA16-Ⅰ和TRSAWmx工作液各50 μL/孔，培养板置于37 ℃、5% CO2的孵箱中静置1 h成胶后，分别在空白孔、RADA16-Ⅰ水凝胶、TRSAWmx水凝胶上滴加100 μL 密度为5×104/mL 的MC3T3-E1细胞悬液。每天换液，在培养的1、3、5、7 d，吸去孔中培养基，按每10 ∶1的比例混合成骨培养液和CCK-8试剂，每孔加入100 μL CCK-8混合液，培养板置于37 ℃、5% CO2的孵箱中孵育1 h后，以酶标仪在450 nm处测D(450)值。

细胞在水凝胶中培养3、7、14 d后，吸净孔内培养基，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，用PBS清洗3次，0.2%Triton X-100室温通透10 min，PBS清洗3次，加入5% BSA封闭1 h，随后PBS清洗3次，加入配置好的罗丹明 -鬼笔环肽(5 U/mL) 工作液，室温避光孵育30 min。用PBS清洗3次， 10 μg/mL的DAPI染液浸没样本，室温避光孵育10 min。 PBS清洗3次，封片后，激光共聚焦荧光显微镜拍照。

细胞在水凝胶中培养3、7 d和14 d后，吸净孔内的培养基，PBS清洗2次，每孔加入1%Triton X-100(100 μL)反复吹打，显微镜观察细胞破碎。严格按照碱性磷酸酶试剂盒说明在96孔板内进行加样，以酶联免疫检测仪在520 nm处测定D(520)，同时用BCA法测定蛋白浓度，并计算ALP的活力。

细胞在水凝胶中诱导培养14 d后，吸净孔内的培养基，PBS清洗2次，4%多聚甲 醛固定20 min后，PBS清洗3次，加入茜素红-S染液室温下染色10 min，PBS清洗残留染液，随机取视野拍照。

在6孔细胞培养板中分别用RADA16-Ⅰ和TRSAWmx工作液成胶，在空白孔、RADA16-Ⅰ水凝胶、TRSAWmx水凝胶上加入3 mL 1×105/mL的MC3T3-E1细胞悬液。培养板置于37 ℃、5%CO2的孵箱中，在培养第14天后，吸净培养基，PBS清洗3次，随后加入TRIzol提取RNA，各取1 μL mRNA逆转录获得cDNA。随后根据TaKaRa公司逆转录反应步骤，进行RT-PCR反应。β-actin、ALP、 骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)引物序列见表 1。使用2-△△Ct对基因相对表达量进行计算。

使用SPSS 14.0 统计软件进行单因素方差分析，结果以x±s表示。

原子力显微镜下分别观察RADA16-Ⅰ 、RADA16-TRSAW、TRSAW和TRASWmx 4组短肽的纳米结构，TRSAW呈云絮状，无法形成纳米纤维状结构。RADA16-TRSAW自组装成粗细不规则的斑片状纳米纤维，长径为(523.7±142.9)nm，纤维之间未连接搭载，表明功能片段的加入会影响RADA16-Ⅰ β折叠形成，从而影响多肽自组装成长的纳米纤维。但是，将RADA16-Ⅰ与RADA16-TRSAW按1 ∶1比例混合后得到的TRSAWmx纤维长径为(810.2±96.7)nm，直径为(17.6±2.1)nm；RADA16-Ⅰ纤维长径为(847.7±87.8)nm，直径为(12.8±1.7)nm。TRSAWmx纳米纤维直径大于RADA16-Ⅰ(P图选项 2.3 不同时相点MC3T3-E1细胞在不同材料表面的增殖及生长形态变化

CCK-8检测细胞增殖结果如图 3所示，培养1 d时，空白组与RADA16-Ⅰ和TRSAWmx组比较，差异有统计学意义(P0.05)；第3、5、7天各组间差异有统计学意义(P图选项 2.4 不同时相点MC3T3-E1细胞在不同材料表面的ALP活性检测和茜素红-S染色结果

ALP试剂盒检测各时间点ALP活性，在3、7、14 d时各组间差异有统计学意义(P图选项 2.5 自组装水凝胶对MC3T3-E1细胞OCN、ALP和VEGF基因表达的影响

根据Real-time PCR检测结果，将空白组表达量定义为1，每组的相对表达量如图 7所示。TRSAWmx组培养细胞的ALP、OCN和VEGF基因表达明显高于空白组和RADA16-Ⅰ组(P