一种快速高效的花椒转基因方法

1.本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其是涉及一种快速高效的花椒转基因方法。

背景技术：

2.花椒属芸香科花椒属植物，耐干旱瘠薄，根系发达，适应性强，因其极高的经济价值和生态价值，被认为是我国主要的生态绿化树种之一。除生态价值外，花椒还是我国重要的调味品、香料及木本油料树种，具有很高的利用价值。在生产实践中人们需要在提高花椒产量、降低采摘难度、提高树种抗性和改良品质等方面进行改良，药用或食用等产品加工上也需要特异性改变某些物质的含量，因此，花椒属植物的育种工作有必要长期而持续地进行。3.我国花椒种质资源十分丰富，大量的生态地理变型和无融合生殖导致的较高遗传稳定性为花椒的育种工作奠定了物质和理论基础。目前花椒的遗传改良主要依靠自然变异，但变异率低及变异的不确定性，使得花椒种质创新和良种繁育工作一直没有取得突破性进展。虽已有一些花椒人工育成品种，但远不能满足生产的需求。因而开辟花椒育种新途径具有重大研究意义。4.传统育种技术对新品种的培育受限于种内与种间杂交隔离，很多重要的性状无法通过常规育种方法进行改良。且传统育种技术耗时较长，效率较低。与之相比，转基因技术具有高效性、精准性等优点，可以缩短育种周期，解决杂交育种可能出现的问题，更有效地转移优良性状，培育具有产量高、果粒大、高精油、高抗性、药用价值高、无刺的花椒新品种，创造出花椒优异种质。因此，建立完整的花椒遗传转化体系，将优良性状集中到某一个品系上，是实现花椒种质创新及性状改良的一个有效途径。

技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种快速高效的花椒转基因方法，能够有效地转移特定优良性状，快速高效地选育花椒新品种。6.为实现上述目的，本发明提供了一种快速高效的花椒转基因方法，花椒转基因高效遗传转化包括如下步骤：7.(1)植物材料准备8.将花椒叶片外植体消毒，切成0.5cm×0.5cm的小块，预培养2d；9.(2)侵染菌体准备10.在添加卡那霉素的lb培养基上挑取单克隆于10ml lb培养基小摇过夜，然后吸取上述菌液500μl再加50ml lb抗性培养基摇菌过夜；11.再于5000r/min离心5min收集菌体，然后用50ml的m20培养基重悬菌体，并控制od值在0.4‑0.6之间；12.(3)侵染13.28℃100r/min侵染8min；14.(4)延长培养15.用500mg/lcef头孢冲洗侵染材料后转入含有250mg/l cef的分化培养基，暗培养2d；16.(5)筛选培养17.再次转入含有25mg/l kan、250mg/l cef的分化培养基培养30d；18.(6)鉴定阳性芽19.(7)转基因成苗。20.优选的，步骤(2)中，lb抗性培养基中添加卡那霉素500mg/l、利福平250mg/l和庆大霉素500mg/l。21.优选的，步骤(2)中，m20培养基中含as乙酰丁香酮和bet甜菜碱。22.优选的，步骤(3)中，侵染后将叶块用无菌滤纸吸干后转移至共培养基中，于暗处共培养3d。23.优选的，步骤(3)中，共培养基中包括ms培养基、激素、10mmol/l as、100mmol/l bet。24.优选的，步骤(6)中，待分化培养后长出植株后，取一片叶子提取总rna，然后根据转基因序列设计特异性引物进行rt‑qpcr鉴定，以未转化材料为对照，检测ct值低于25则为阳性转基因芽。25.优选的，步骤(7)中，将鉴定后的阳性芽转移到生根培养基，进行生根处理并最终获得转基因植株。26.因此，本发明采用上述一种快速高效的花椒转基因方法，技术效果如下：27.(1)本发明方法简化了花椒遗传转化的程序，操作简单，有效地缩短了转化周期，使得转基因后代遗传趋于稳定，外源基因表达水平明显提升，转化效率大大提高。28.(2)本发明以花椒为材料，研究培养时间、侵染时间、侵染浓度、共培养时间及选择压等对不定芽再生率及转化率的影响，建立花椒遗传转化体系，各步骤和参数之间协同作用，进一步提高了花椒转基因的效率。29.(3)本发明可实现花椒转基因植株的快速培育，为花椒属植物基因功能研究和分子育种奠定基础，为创造培育出优质花椒新品种提供技术支撑。30.(4)本发明方法不仅包括转基因植株的步骤，还包括对转基因植株的验证，创造性地建立了完整的花椒遗传转化体系。31.(5)本发明采用了rt‑qpcr鉴定来验证转基因植物是否为阳性，科学严谨，验证结论可信度高。32.(6)本发明方法操作简便，成本低，适用范围广，具有较大的科研价值。33.综上，通过选定目的基因、植物材料准备、侵染菌体准备、侵染、延长培养、筛选培养、鉴定阳性芽并将其转移到生根培养基，进行生根处理，可以快速高效地获得转基因植株，培育出优质花椒新品种。34.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。附图说明35.图1是植物材料准备图示；36.图2是植物分化示意图；37.图3是愈伤组织形成示意图；38.图4是转基因鉴定阳性芽示意图；39.图5是阴性、阳性植株凝胶对比示意图。具体实施方式40.以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。41.如图所示，一种快速高效的花椒转基因方法，花椒转基因高效遗传转化包括如下步骤：42.(1)植物材料准备43.将花椒叶片外植体消毒，切成0.5cm×0.5cm的小块，预培养2d；44.(2)侵染菌体准备45.在添加卡那霉素的lb培养基上挑取单克隆于10ml lb培养基小摇过夜，然后吸取上述菌液500μl再加50ml lb抗性培养基摇菌过夜；46.再于5000r/min离心5min收集菌体，然后用50ml的m20培养基重悬菌体，并控制od值在0.4‑0.6之间；47.lb抗性培养基中添加卡那霉素500mg/l、利福平250mg/l和庆大霉素500mg/l。m20培养基中含as乙酰丁香酮和bet甜菜碱。48.(3)侵染49.28℃100r/min侵染8min；侵染后将叶块用无菌滤纸吸干后转移至共培养基中，于暗处共培养3d。共培养基中包括ms培养基、激素、10mmol/l as、100mmol/l bet。50.(4)延长培养51.用500mg/lcef头孢冲洗侵染材料后转入含有250mg/l cef的分化培养基，暗培养2d；52.(5)筛选培养53.再次转入含有25mg/l kan、250mg/l cef的分化培养基培养30d；54.(6)鉴定阳性芽55.待分化培养后长出植株后，取一片叶子提取总rna，然后根据转基因序列设计特异性引物进行rt‑qpcr鉴定，以未转化材料为对照，检测ct值低于25则为阳性转基因芽。56.(7)转基因成苗。57.将鉴定后的阳性芽转移到生根培养基，进行生根处理并最终获得转基因植株。58.因此，本发明采用上述一种快速高效的花椒转基因方法，能够有效地转移特定优良性状，快速高效地选育花椒新品种。59.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。