两面针中7个木脂素类化合物及其提取方法和应用

1.本发明涉及药物提取分离技术领域，具体涉及两面针中7个木脂素类化合物及其提取方法和应用。

背景技术：

2.两面针zanthoxylum nitidum(rutaceae)，芸香科花椒属木质藤本植物，别名入地金牛、双面刺、山椒、下山虎；其主要分布于中国广东、广西、福建、湖南等地，为我国传统常用中药。其根、茎、叶、果皮皆可入药，传统上用于治疗胃痛、牙痛、风湿性关节痛、创伤和毒蛇咬伤。3.现代药理学研究表明两面针不仅具有传统的消肿止痛作用，而且具有抗炎，镇痛作用、止血、抗肿瘤和抗菌等生物活性。自1959年对两面针进行研究以来，已从两面针中分离鉴定出多种化学成分，包括生物碱、香豆素、木脂素、黄酮类、挥发油、甾体、烷基酰胺等。它们具有显著的抗肿瘤、抗炎、抗创伤、镇痛、止血、抗肿瘤、抗菌等作用。近几年有从两面针中分离得到木脂素类化合物相关研究报道，但目前还未见有本发明所分离的7个木脂素类化合物的相关报道。

技术实现要素：

4.本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供两面针中7个木脂素类化合物及其提取方法和应用，本发明通过化学分离得到了7个木脂素类化合物，该7个脂素类化合物未曾被公开报道，该7个木脂素类化合物具有体外抗肿瘤活性，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：6.本发明首先提供两面针中的7个木脂素类化合物，其结构式分别如下：7.8.本发明还提供两面针中7个木脂素类化合物的提取方法，包括以下步骤：9.(1)以两面针为原料，采用有机溶媒提取获得两面针提取物；10.(2)将两面针提取物溶于质量分数为3％的酒石酸溶液，滤去不溶物a后将滤液用乙酸乙酯萃取，分离得乙酸乙酯萃取物和酸水不溶物；11.(3)将乙酸乙酯萃取物和酸水不溶物合并，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。12.(4)将纯化后的乙酸乙酯部位上硅胶柱层析，以二氯甲烷和甲醇组成的洗脱剂作为溶剂体系进行梯度洗脱，对馏分进行分析检测，收集含1-7所示化合物的目标馏分，所得含目标化合物的目标馏分依次用反相色谱柱、葡聚糖凝胶柱、制备液相进行分离，即得到目标化合物。13.在本发明的提取方法中，优选步骤(1)是以两面针根部为原料，提取所用的溶媒优选为体积浓度为70-100％甲醇或体积浓度为75-95％乙醇或者丙酮；提取的方式为常温浸提、加热提取、超声波提取或回流提取等，提取所得的提取液经过浓缩，得到浸膏，浸膏用于后续步骤的提取分离。14.在本发明的提取方法中，优选步骤(2)中当两面针提取物溶于3％的酒石酸溶液后，调节溶液的ph＝2～3；滤去不溶物a后滤液用乙酸乙酯萃取的次数为3-4次。15.在本发明的提取方法中，步骤(3)中依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，优选每种萃取液萃取的次数为3-4次。16.在本发明的提取方法中，步骤(4)中，硅胶柱层析时，按照二氯甲烷和甲醇按体积比为100：1，80：1，50：1，40：1，30：1，20：1，15：1，10：1，8：1，5：1，2：1，1：1进行梯度洗脱，每个梯度浓度的洗脱剂体积为柱体积的3-4倍；每500ml馏分进行收集，对馏分进行分析检测。17.在本发明的提取方法中，步骤(4)中，在用反相色谱柱分离时，优选洗脱剂由甲醇和水按不同的体积比组成的，按甲醇含量为20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的梯度洗脱，每300ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份。18.在本发明的提取方法中，在用葡聚糖凝胶柱分离时，优选洗脱剂为甲醇，每30ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份；19.在本发明的提取方法中，在用制备液相分离时，流速为7ml/min，检测波长为210nm，其中各化合物的分离条件是：化合物4的分离条件是流动相meoh：h2o：tfa的体积比为30:70:0.01,收集tr为61.0min的组分；化合物6的分离条件是流动相meoh：h2o的体积比为60:40，收集tr为51min的组分；化合物7的分离条件是流动相mecn：h2o的体积比为35:65，收集tr为26min的组分；化合物1的分离条件是流动相为meoh：h2o的体积比为45:55,收集tr为22min的组分；化合物5的分离条件是流动相为meoh：h2o的体积比为45:55,收集tr为24min的组分；化合物2的分离条件是流动相meoh：h2o的体积比为45:55,收集tr为26min的组分；化合物3的分离条件是流动相meoh：h2o的体积比为60:40,收集tr为31min的组分。20.在本发明的提取方法中，步骤(4)对馏分进行分析检测时，检测手段可以是tlc、hplc或hplc-ms。21.本发明还保护上述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。22.本发明还保护上述化合物或其药学上可接受的盐为活性成分制备的抗肿瘤药物。23.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：24.本发明提供了7个结构新颖的木脂素类化合物，以及它们的提取方法和应用，化合物的提取方法简单易操作。通过考察化合物对多种肿瘤的抑制作用，结果表明该化合物具有体外抗肿瘤活性，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。具体实施方式25.为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。26.实施例127.两面针中7个木脂素类化合物的提取方法，包括以下步骤：28.(1)取两面针干燥全株部分28kg，粉碎，用体积浓度为95％乙醇为溶媒，回流提取3次，合并提取液，减压回收溶剂，得到两面针提取物浸膏3.4kg；29.(2)将两面针提取物浸膏溶于质量分数为3％的酒石酸溶液，调节浸膏溶液的ph＝2，滤去不溶物a后将滤液用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩回收溶剂，分离得乙酸乙酯萃取物和酸水不溶物；30.(3)将乙酸乙酯萃取物和酸水不溶物合并，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每种萃取液萃取的次数为3次，分别合并和浓缩得纯化的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；31.(4)将纯化后的乙酸乙酯部位(700g)上硅胶柱层析，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，按二氯甲烷和甲醇体积比为100：1，80：1，50：1，40：1，30：1，20：1，15：1，10：1，8：1，5：1，2：1，1：1进行梯度洗脱，每个梯度浓度的洗脱剂体积为柱体积的3倍，每500ml馏分进行收集，分段收集样品，以tlc进行划段合瓶得到11段馏分，之后用hplc-uv和hplc-ms分析检测，发现含目标化合物的馏分，收集含结构式1-7所示化合物的目标馏分。32.所得含目标化合物的目标馏分先用反相色谱柱进行分离，反相色谱柱分离的洗脱剂由甲醇和水按不同的体积比组成的，按甲醇含量为20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的梯度洗脱，每300ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份。33.目标馏份再用葡聚糖凝胶柱分离，葡聚糖凝胶柱分离的洗脱剂为甲醇，每30ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份；34.目标馏份再用制备液相分离，制备液相的条件是流速为7ml/min，检测波长为210nm，各化合物的分离条件是：化合物4的分离条件是流动相meoh：h2o：tfa的体积比为30:70:0.01,收集tr为61.0min的组分；化合物6的分离条件是流动相meoh：h2o的体积比为60:40，收集tr为51min的组分；化合物7的分离条件是流动相mecn：h2o的体积比为35:65，收集tr为26min的组分；化合物1的分离条件是流动相为meoh：h2o的体积比为45:55,收集tr为22min的组分；化合物5的分离条件是流动相为meoh：h2o的体积比为45:55,收集tr为24min的组分；化合物2的分离条件是流动相meoh：h2o的体积比为45:55,收集tr为26min的组分；化合物3的分离条件是流动相meoh：h2o的体积比为60:40,收集tr为31min的组分。35.对所得产物用nmr及hresims等进行结构分析，确定为目标化合物1-7。36.实施例237.两面针中7个木脂素类化合物的提取方法，包括以下步骤：38.(1)取两面针干燥全株部分27kg，粉碎，用体积浓度为75％的乙醇常温浸提3次，每次3h，合并提取液，减压回收溶剂，得到两面针提取物浸膏。39.(2)将两面针提取物浸膏溶于质量分数为3％的酒石酸溶液，调节浸膏溶液的ph＝3，滤去不溶物a后将滤液用乙酸乙酯萃取4次，减压浓缩回收溶剂，分离得乙酸乙酯萃取物和酸水不溶物；40.(3)将乙酸乙酯萃取物和酸水不溶物合并，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每种萃取液萃取的次数为4次，分别合并和浓缩得纯化的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；41.(4)将纯化后的乙酸乙酯部位上硅胶柱层析，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，按二氯甲烷和甲醇按体积比为100：1，80：1，50：1，40：1，30：1，20：1，15：1，10：1，8：1，5：1，2：1，1：1进行梯度洗脱，每个梯度浓度的洗脱剂体积为柱体积的4倍，每500ml馏分进行收集，分段收集样品，以tlc进行划段合瓶得到11段馏分，之后用hplc-uv和hplc-ms分析检测，发现含目标化合物的馏分，收集含1-7所示化合物的目标馏分。42.所得含目标化合物的目标馏分先用反相色谱柱进行分离，反相色谱柱分离的洗脱剂由甲醇和水按不同的体积比组成的，按甲醇含量为20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的梯度洗脱，每300ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份。43.目标馏份再用葡聚糖凝胶柱分离，葡聚糖凝胶柱分离的洗脱剂为甲醇，每30ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份；44.目标馏份再用制备液相分离，制备液相的条件是流速为7ml/min，检测波长为210nm，其中各化合物的分离条件是：化合物4的分离条件是流动相meoh：h2o：tfa的体积比为30:70:0.01,收集tr为61.0min的组分；化合物6的分离条件是流动相meoh：h2o的体积比为60:40，收集tr为51min的组分；化合物7的分离条件是流动相mecn：h2o的体积比为35:65，收集tr为26min的组分；化合物1的分离条件是流动相为meoh：h2o的体积比为45:55,收集tr为22min的组分；化合物5的分离条件是流动相为meoh：h2o的体积比为45:55,收集tr为24min的组分；化合物2的分离条件是流动相meoh：h2o的体积比为45:55,收集tr为26min的组分；化合物3的分离条件是流动相meoh：h2o的体积比为60:40,收集tr为31min的组分。45.对所得产物用nmr及hresims等进行结构分析，确定为目标化合物1-7。46.实施例347.重复实施例1，不同的是：将步骤(1)中的提取溶媒由体积浓度为95％的乙醇更改为100％的甲醇。48.对所得产物用nmr及hresims等进行结构分析，确定为目标化合物1-7。49.实施例450.重复实施例2，不同的是：将步骤(1)中的提取溶媒由体积浓度为75％的乙醇更改为70％的甲醇，提取方式采用超声波提取。51.对所得产物用nmr及hresims等进行结构分析，确定为目标化合物1-7。52.实施例553.重复实施例1，不同的是：将步骤(1)中的提取溶媒由体积浓度为95％的乙醇更改为80％的甲醇，提取方式采用加热提取，温度为60℃，提取时间为3h。54.对所得产物用nmr及hresims等进行结构分析，确定为目标化合物1-7。55.实施例656.重复实施例1，不同的是：将步骤(1)中的提取溶媒由体积浓度为95％的乙醇更改4),108.2(c-5),125.8(c-6),190.1(c-7),127.6(c-8),148.0(c-9),123.5(c-1'),107.9(c-2'),148.2(c-3'),148.4(c-4'),108.9(c-5'),121.9(c-6'),153.2(c-7'),120.0(c-8'),55.6(c-9'),102.2(-och2o-),101.6(-och2o-)；71.hresi-ms m/z 389.0619[m+na]+,(calcd for c20h14o7na+:389.0632)。[0072]化合物4：[0073]1h nmr(400mhz,cd3od,25℃)δh 7.48(1h,d,j＝1.6hz,h-2),6.96(1h,d,j＝8.2hz,h-5),7.70(1h,dd,j＝8.2,1.6hz,h-6),4.54(1h,dd,j＝16.0,7.8hz,h-8),4.65(1h,t,j＝8.7hz,h-9),4.26(1h,dd,j＝8.7,7.8hz,h-9),3.17(1h,dt,j＝7.8,3.9hz,h-11),3.98(1h,dd,j＝11.2,3.9hz,h-12),3.75(1h,dd,j＝11.2,3.9hz,h-12),6.08(2h,s,-och2o-)；[0074]13c nmr(100mhz,cd3od,25℃)δc 131.7(c-1),108.9(c-2),154.2(c-3),150.1(c-4),109.1(c-5),126.7(c-6),196.9(c-7),45.7(c-8),69.9(c-9),178.9(c-10),47.1(c-11),60.4(c-12),103.7(-och2o-)；[0075]hresi-ms m/z 287.0526[m+na]+,(calcd for 287.0526)。[0076]化合物5：[0077]1h nmr(400mhz,cd3od,25℃)δh 6.97(1h,d,j＝1.5hz,h-2),6.89(1h,overlapped,h-5),6.84(1h,overlapped,h-6),4.69(1h,d,j＝4.5hz,h-7),3.12(1h,overlapped,h-8),4.21(1h,overlapped,h-9),3.84(1h,m,h-9),6.76(2h,d,j＝8.5hz,h-2',3'),7.19(2h,d,j＝8.5hz,h-5',6'),4.72(1h,d,j＝4.5hz,h-7'),3.12(1h,overlapped,h-8'),4.21(1h,overlapped,h-9'),3.81(1h,m,h-9'),4.53(2h,d,j＝6.7hz,h-1”),5.46(1h,m,h-2”),1.76(3h,s,h-4”),1.72(3h,s,h-5”),3.82(3h,s,-och3)；[0078]13c nmr(100mhz,cd3od,25℃)δc 135.5(c-1),111.3(c-2),151.2(c-3),149.1(c-4),115.1(c-5),119.7(c-6),87.3(c-7),55.5(c-8),72.7(c-9),133.0(c-1'),116.2(c-2'),128.7(c-3'),158.3(c-4'),128.7(c-5'),116.2(c-6'),87.4(c-7'),55.2(c-8'),72.5(c-9'),67.0(c-1”),121.2(c-2”),138.8(c-3”),25.9(c-4”),18.2(c-5”),56.4(-ome)；[0079]hresims m/z 419.1846[m+na]+,(calcd for 419.1829)。[0080]化合物6[0081]1h nmr(400mhz,cd3od,25℃)δh 7.33(1h,d,j＝1.5hz,h-2),7.20(1h,d,j＝8.1hz,h-5),7.38(1h,dd,j＝8.1,1.5hz,h-6),3.67(1h,m,h-8),4.16(1h,t,j＝8.9hz,h-9),3.38(1h,t,j＝8.9hz,h-9),7.23(1h,d,j＝1.5hz,h-2'),7.15(1h,d,j＝8.1hz,h-5'),7.20(1h,d,j＝8.1hz,6'),4.82(1h,d,j＝6.6hz,h-7'),3.33(1h,m,h-8'),4.43(2h,m,h-9'),6.35(2h,s,-och2o-),6.30(2h,s,-och2o-)；[0082]13c nmr(100mhz,cd3od,25℃)δc 132.9(c-1),108.5(c-2),149.2(c-3),148.7(c-4),108.8(c-5),121.7(c-6),111.5(c-7),58.0(c-8),71.3(c-9),136.3(c-1'),107.5(c-2'),149.4(c-3'),149.0(c-4'),109.0(c-5'),120.7(c-6'),89.2(c-7'),54.5(c-8'),70.5(c-9'),102.6(-och2o-),102.4(-och2o-)；[0083]hresi-ms m/z m/z 393.0955[m+na]+,(calcd for 393.0945)。[0084]化合物7[0085]1h nmr(400mhz,cd3od,25℃)δh 6.95(1h,s,h-2),7.00(1h,d,j＝8.0hz,h-5),6.83(1h,d,j＝8.0hz,h-6),3.28(1h,d,j＝8.8hz,h-8),3.76(1h,t,j＝8.8hz,h-9),2.99(1h,t,j＝8.8hz,h-9),6.79(1h,d,j＝1.9hz,h-2'),6.73(1h,d,j＝8.1hz,h-5'),7.20(1h,dd,j＝8.1,1.9hz,6'),4.37(1h,d,j＝6.7hz,h-7'),2.96(1h,m,h-8'),4.06(1h,dd,j＝8.9,6.7hz,h-9'),4.01(1h,dd,j＝8.9,1.5hz,h-9'),5.97(2h,s,-och2o-)；[0086]13c nmr(100mhz,cd3od,25℃)δc 133.0(c-1),108.5(c-2),149.2(c-3),149.0(c-4),108.8(c-5),121.7(c-6),111.5(c-7),58.0(c-8),71.2(c-9),133.6(c-1'),114.4(c-2'),146.5(c-3'),146.2(c-4'),116.2(c-5'),119.0(c-6'),89.4(c-7'),54.2(c-8'),70.6(c-9'),102.6(-och2o-)；[0087]hresi-ms ion at m/z 397.0673[m+k]+,(calcd for 397.0684)。[0088]因此，可确定上述化合物nitidumlignan d-j的结构式如下述式(i)所示：[0089][0090]其中，化合物1中r为＝o，化合物2中r为h，化合物6中r1-r2为-och2o-，化合物7中r1、r2均为-oh。[0091]三、产品抗肿瘤作用研究[0092]以临床使用的肿瘤治疗药物依托泊苷为阳性对照药,以空白培养基作阴性对照,以snu638(人胃癌细胞),mda-mb-231(人乳腺癌细胞),sk-hep-1(人肝癌细胞)，a549(人非小细胞肺癌细胞),hct116(人结肠癌细胞)为受试细胞株对化合物进行了体外抗肿瘤活性测试。[0093]受试细胞株维持在添加10％胎牛血清和1％抗菌素(aa)的rpmi培养基中(psf；100单位/ml青霉素g钠、100μg/ml链霉素和250ng/ml两性霉素b)。细胞在37℃、5％co2、湿润环境下培养。[0094]在细胞株培养72h后使用磺酰罗丹明b(srb)方法测定细胞存活率，对数生长期的细胞株接种到96孔板上，每孔加细胞悬液190μl，细胞悬液的细胞浓度为8～3×104个/ml。给药组分别加入50μl，10μl，2μl，0.4μl含有不同浓度溶于dmso的本发明化合物的样品10μl，阳性对照组加入20μl，4μl，0.8μl，0.16μl含不同浓度依托泊苷的样品，阴性组不加样品加入和样品组一致的空白dmso 10μl，并进一步孵育72h。用10％三氯乙酸(tca)固定细胞，沉淀剩余的蛋白质，并在0.1％的醋酸中用srb溶液染色。染色蛋白溶解在10mm tris溶液(ph＝10)中，用versamax酶联免疫吸附测定仪在515nm处测定。计算每个给药孔细胞增殖抑制率，并计算其ic50值，结果如下述表1所示：[0095]表1：[0096][0097]由表1可知，本发明所述部分化合物对多种肿瘤细胞均有良好的抑制作用，表明本发明所述化合物具有良好的抗肿瘤作用，有望用于抗肿瘤药物的制备。[0098]上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。