肉桂多次ig给药在肾阳虚大鼠体内的积累和代谢分析

1.3药材与试剂

肉桂饮片（产地广西，批号：160724，由北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为C. cassiaPresl干燥树皮），购自北京鹤延龄药业发展有限公司；氢化可的松注射液（批号：2011171，国药集团容生制药有限公司）；环磷酸腺苷（cAMP）ELISA试剂盒和环磷酸鸟苷（cGMP）ELISA试剂盒（江苏科特生物有限公司）；乙腈（质谱纯，Fisher公司）；甲酸（质谱纯，德国Merk公司）；超纯水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；其他试剂均为市售分析纯（北京化工厂）。

2方法

2.1肉桂提取液的制备

肉桂饮片330 g加入8倍量蒸馏水浸泡30 min，用挥发油提取器提取4 h，收集挥发油，即得肉桂油（31 g）；滤过提取液，减压浓缩，冷冻干燥，得干浸膏40 g，出膏率为21.5%。精密称取9.01 g干浸膏、7.09 g肉桂油分散于50 mL去离子水中制成质量浓度为0.16 g·mL-1的肉桂混悬液（含肉桂油9.4%），每毫升相当于0.75 g肉桂生药量，备用。

2.2肾阳虚大鼠模型的制备 ［ 9］及分组给药

大鼠适应性饲养7 d后，随机分为对照组（每日ip等体积0.9%氯化钠溶液）和模型组，模型组大鼠ip 10 mg·kg-1·d-1氢化可的松注射液，连续15 d，每天观察大鼠生存状态。造模结束后大鼠眼眶取血，按试剂盒方法测定血浆cAMP、cGMP水平。后将模型组大鼠分为肉桂组和肾阳虚组，肉桂组大鼠按生药量1.35 g·kg-1·d-1［10-11］ig肉桂混悬液，肾阳虚组大鼠每日ig同体积去离子水，连续15 d。

2.3样品采集

2.3.1血浆样品和肾脏组织样品取肾阳虚组和肉桂组大鼠各5只，末次给药前禁食12 h，自由饮水。末次给药后2 h，ip 25%乌拉坦麻醉大鼠，麻醉后立即解剖，由腹主动脉取血，置于肝素化试管中，15 000 r·min-1离心10 min，取血浆存于-20 ℃，待测。再用冰冷的0.9%氯化钠溶液经心脏灌注全身，排出血液至肝脏呈土黄色后，取出肾组织，在冰浴中用0.9%氯化钠溶液洗净，用滤纸吸干表面水分，样品置于-80 ℃保存。

2.3.2尿液和粪便样品取肾阳虚组和肉桂组大鼠各3只，末次给药前禁食12 h，自由饮水。末次给药后置于代谢笼中，自由饮水，分别收集0～24 h尿液和粪便样品。置于-80 ℃保存。

2.4样品处理

2.4.1血浆样品处理将同组大鼠血浆样品混合，涡旋振荡，混匀。取各组混合血浆样品1 mL，加入4倍甲醇，涡旋振荡1 min，混匀，以15 000 r·min-1离心10 min，取出全部上清液，氮气吹干。残渣用1 mL甲醇，超声复溶，以15 000 r·min-1离心15 min，取上清液0.45 μm微孔滤膜滤过后于4 ℃保存，待测。

2.4.2肾脏组织样品处理取同组肾脏样品剪碎、混合并摇匀，取0.5 g混合肾组织样品置于离心管中，加入1 mL生理盐水，充分匀浆后吸取400 μL匀浆液，15 000 r·min-1离心10 min，取上清，加入1.2 mL乙腈，涡旋混匀后继续在15 000 r·min-1下离心10 min，取上清，统一氮气吹干，使用1 mL甲醇复溶，经0.22 μm有机滤膜滤过后于4 ℃保存，待测。

2.4.3尿液样品处理将同组尿液样品混合，涡旋振荡，混匀。取混合尿液样品2 mL，加在预处理好的SPE柱（预处理方法先用2 mL色谱甲醇活化后，再用3 mL超纯水洗净甲醇溶液），用2 mL超纯水洗去水溶性杂质，最后用1mL甲醇洗脱分析物，氮气吹干，加入400 μL甲醇复溶，经0.22 μm有机滤膜滤过后于4 ℃保存，待测。

2.4.4粪便样品处理取同组粪便样品剪碎、混合并摇匀，称取0.5 g混合粪便样品，以体积比1∶4加入甲醇，浸泡研碎后，匀浆，取0.5 mL匀浆液，超声提取30 min。15 000 r·min-1离心15 min，精密吸取上清液0.2 mL，甲醇定量稀释至1 mL，经0.22 μm有机滤膜滤过后于4 ℃保存，待测。

2.5检测条件 ［ 7］

色谱条件：Waters BEH C 18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；C 18 保护柱（10 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相为0.05%甲酸-水（A）-0.05%甲酸-乙腈（B）；洗脱梯度：0～2 min，5%B；2～15 min，5%～16%B；15～20 min，16%～50%B；20～28 min，50%～80%B；28～33 min，80%～100%B；33～35 min，100%B；35.1～40 min，5%B。体积流量0.3 mL·min-1；柱温35 ℃；进样量：10 µL；分流比4∶1；样品架温度4℃。

质谱条件：电喷雾电离（ESI）离子源；负离子模式；喷雾电压：3 000 V；干燥器温度：350 ℃；雾化器设置：206.90 kPa；鞘气（N 2 ）体积流量：10.0 L·min-1；扫描范围m/z：100～1 200。

2.6数据处理

利用Xcalibur工作站进行数据处理。

3结果

3.1肾阳虚模型评价

造模期间模型组大鼠精神萎靡不振、烦躁、拱背扎堆、毛发干枯无光泽，身体发凉，大便溏薄，尿量增多，抓取激惹反应减弱，造模结束时血浆cAMP水平较对照组显著降低（P＜0.01）、cGMP水平较对照组显著升高（P＜0.05），确定肾阳虚证造模成功，结果见表1。

3.2各样品中肉桂成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS鉴定

样品在负离子模式下一级全扫描（m/z：100～1 200），鉴定肉桂原型成分和代谢产物。药物在生物体内发生代谢保留药物原型成分基本骨架，再发生官能团加减、结合反应等，所以存在中性丢失和特征质谱裂解碎片代谢产物。通过与文献报道 ［ 7］中已知对照品比对保留时间、相对分子质量等分别对从生物样本中获得的数据进行解析。最终从大鼠血浆、尿液、粪便和肾组织样本中初步鉴定出3个原型成分和21个代谢产物，见表2。肾阳虚组和肉桂组总离子流图见图1。

3.3代谢途径分析

3.3.1原花青素类肉桂中丰富的原花青素类成分 ［ 4-5］在肠道菌群作用下可降解为单体和有机酸或酯类，并发生结合甲基化、葡萄糖醛酸化等反应，通过尿液和胆汁排泄 ［ 12］，M1～M11碎片离子同文献报道一致，为儿茶素的甲基化和葡萄糖醛酸化产物 ［ 13-14］，代谢途径见图2。

3.3.2木脂素类结肠末端和盲肠 ［ 15］是木脂素类成分主要吸收部位，植物木脂素糖苷类成分先在肠内水解，脱糖基后生成苷元，进一步通过水解、去甲基化、去羟基化、不对称加氢等途径代谢为肠二醇和肠内脂，最终以肠二醇和肠内脂的葡萄糖醛酸化产物和硫酸化产物从尿液和胆汁中排出 ［ 16-17］。在ig给予肉桂水提物的大鼠体内共检测到8个（M13～M20）木脂素类相关代谢产物，代谢途径为葡萄糖醛酸化和硫酸化，如图3所示。

3.3.3二萜类肉桂中的二萜类成分在尿液和血浆中以原型检出，推测该类成分代谢相对稳定，不易形成II相结合产物。共检测到2个二萜成分（M21～M22）。

3.3.4其他类检测到肉桂醛和肉桂酸的代谢产物马尿酸，以及原型成分丁香酸。肉桂醛代谢途径见图4。

4讨论

长期ig肉桂提取物后，在肾阳虚大鼠体内外共鉴定出24个代谢物及原型成分，包括原花青素类代谢物、木脂素类代谢物、肉桂醛的代谢物，及原型成分二萜类、阿魏酸、丁香酸。原花青素类在生物体内以水解和降解反应为主，再发生甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化结合反应，由尿液排出。木脂素类成分在生物体内存在肝肠循环 ［ 15］，产生硫酸化和葡萄糖醛酸化反应，借助尿液和粪便清除 ［ 16-17］。二萜化合物的代谢比较稳定，二相结合困难，在血液、尿液、粪便和肾脏中检出原型成分。挥发性成分肉桂醛在肾阳虚大鼠体内不稳定，易发生代谢，转化为马尿酸排出体外，推测肉桂醛可能通过代谢反应发挥药效。综合分析吸收代谢结果及相关原型成分的裂解规律，推测肉桂提取物在肾阳虚大鼠体内代谢反应广泛，代谢途径以甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化反应为主。

大部分成分主要分布在尿液中，血液、粪便和肾脏中检测到的成分较少。但前期研究明确了肉桂对肾组织病理损伤的改善作用，故本研究重点关注肾脏组织中肉桂成分的积累情况，木脂素类代谢产物和原型成分锡兰肉桂醇、脱水锡兰肉桂醇在肾脏聚集，锡兰肉桂醇、脱水锡兰肉桂醇等肉桂中二萜类化合物有抗补体的药理作用 ［ 5］，可调节免疫系统治疗肾阳虚证，可能是作用于肾脏的药效物质基础。木脂素类化合物药理作用广泛，涉及消化系统、心血管系统、中枢神经系统、生殖系统等方面 ［ 18］，包括抗病毒、抗肿瘤、抗菌、提高免疫力等 ［ 19］，其代谢产物可能发挥药效作用。

与短期给药检测正常大鼠体内代谢产物相比 ［ 7］，在长期给药的前提下，肉桂提取物在肾阳虚大鼠体内检测到的成分总量更少，但在血液中检测到肉桂中的原型成分丁香酸、阿魏酸，丁香酸具有广泛的药理作用，如抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、抗糖尿病以及对心脏、肝脏和大脑保护作用 ［ 20-21］，可通过保护大脑，调控下丘脑功能，调节神经内分泌免疫网络治疗肾阳虚证。阿魏酸有改善心肌缺血、抑制血小板聚集、扩张冠状动脉、增加血流量等药理作用 ［ 22］，其改善心肌缺血、增加血流量等作用类似于温肾助阳方剂的温煦、推动功能，可改善肾阳虚证畏寒肢冷等症状。推测丁香酸和阿魏酸可能是肉桂中治疗肾阳虚的药效成分。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：张哲，汪祺，陈建华，赵雯雯，孙秀蕊，韩洪翠，王雪，荆紫琪，张玉杰，马双成．肉桂多次ig给药在肾阳虚大鼠体内的积累和代谢分析 [J]. 药物评价研究, 2022, 45(12): 2450-2457 .返回搜狐，查看更多