一种甲氨蝶呤的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其应用

本发明涉及一种核酸适配体、核酸适配体衍生物及其应用，具体涉及一种可结合甲氨蝶呤的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其在识别并结合甲氨蝶呤的应用。

背景技术：

甲氨蝶呤(mtx)是一种叶酸拮抗剂，广泛用于多种癌症和炎症性疾病的临床治疗。据报道，近700种癌细胞对mtx敏感，其中急性淋巴母细胞白血病细胞系和急性髓系白血病细胞系对mtx最敏感。mtx能够干扰四氢叶酸的合成，进而抑制细胞内dna和rna的合成，从而起到抗肿瘤的效果。然而，mtx存在着治疗窗窄，毒副作用大的问题，大剂量甲氨蝶呤（hdmtx）诱导的不良反应主要有肾毒性、骨髓抑制、黏膜炎、胃肠道反应和神经毒性，严重的甚至有可能危及患者的生命安全。根据美国fda推荐标准，hdmtx用药后的清除率需达到24小时血药浓度≤10μmol/l，48小时≤1μmol/l，72小时＜0.2μmol/l，目前国内大多数研究采用的标准是24小时血药浓度≤10μmol/l，48小时≤1μmol/l，72小时＜0.1μmol/l。目前，临床上mtx血药浓度的监测常常是利用高效液相色谱（hplc）、荧光偏振免疫分析（fpia）、酶联免疫（elisa）或液相色谱结合串联质谱（lc-ms/ms）。这些方法或成本高或耗时长或操作复杂，因此，如何快速高效简便的检测mtx的血药浓度已成为亟待解决的问题。

核酸适配体（aptamer）通常是利用指数富集配体的系统进化技术（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex），从核酸分子文库中筛选得到的，能够高亲和力，高特异性识别靶标的单链核酸分子，由于其具有类似抗体的性质，可被人工合成，所以又被称为化学抗体。aptamer相较于抗体具有更多的优势，如具有更高的亲和力和特异性，无免疫原性，能够化学合成，成本低，稳定性好，易于保存等。近年来，aptamer已广泛用于各种分子探针和生物传感器的研发。

开发特异性识别mtx的aptamer，将有望提供一种新的快速高效检测mtx血药浓度的手段。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够高特异性和高亲和力结合mtx的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种mtx的核酸适配体。所述的核酸适配体的核苷酸序列包括以下序列1-序列5所示的dna片段：

序列1为hmx72：

ggaggctctcgggacgacggacgcgggatgtttgggggacccacgtttgtcgtcccgatgctgcaatcgtaa

序列2为hmx38t：

cgacggacgcgggatgtttgggggacccacgtttgtcg

序列3为hmx38：

gggcgaacgcgggatgtttgggggacccacgttcgccc

序列4为hmx32：

cgaacgcgggatgtttgggggacccacgttcg

序列5为hmx24：

cgcgggatgtttgggggacccacg；

上述的核酸适配体中，所述核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60%以上的适配体也可用于甲氨蝶呤的特异性的结合。

上述的核酸适配体中，所述序列的5’端或3’端连接或标记其他功能基团或分子，并与所述适配体具有相同功能的适配体也可用于甲氨蝶呤的特异性的结合，所述其他功能基团或分子选自：生物素、氨基、巯基、荧光素、地高辛、放射性同位素、酶标记或纳米发光材料。

本发明还提供一种特异性结合甲氨蝶呤的核酸适配体衍生物，所述的核酸适配体衍生物是上述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是改造成的相应锁核酸或肽核酸。

以上不论是衍生出的核酸适配体还是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构性质和功能，即都可用于甲氨蝶呤特异性结合。

本发明还提供一种上述的核酸适配体或者上述核酸适配体衍生物在检测血液、血清、血浆、尿液中甲氨蝶呤的应用。

本发明还提供一种上述的核酸适配体或者上述核酸适配体衍生物在甲氨蝶呤分离与纯化中的应用。

本发明还提供一种上述的核酸适配体或者上述核酸适配体衍生物在制备甲氨蝶呤检测探针及靶点探针中的应用。

本发明较于现有的技术，其优势在于

1.提供了新的甲氨蝶呤核酸适配体，该核酸适配体能够特异性识别并结合甲氨蝶呤；

2.提供的甲氨蝶呤适配体可通过化学合成且可标记各种报告分子，批次差异小，分子量小，且核酸适配体稳定性高，能长期保存使用。

3.提供的甲氨蝶呤核酸适配体修饰不同的报告分子后能够构建检测甲氨蝶呤的血药浓度的生物传感器。

附图说明

图1为甲氨蝶呤核酸适配体的筛选流程图；

图2为甲氨蝶呤核酸适配体的二级结构图；

图3为微量热法表征核酸适配体结合解离常数示意图；

图4为甲氨蝶呤核酸适配体38-3生物传感器示意图；

图5为38-3生物传感器识别甲氨蝶呤的荧光曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步的详细说明：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：甲氨蝶呤核酸适配体筛选。

1、合成随机单链dna文库（ggaggctctcgggacgacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngtcgtcccgatgctgcaatcgtaa），biotin标记的与单链dna文库的互补链（tcccgagagcctcctttt-biotin），正向引物（ggaggctctcgggacgac）以及biotin标记的反向引物（biotin-ttacgattgcagcatcgggacgac）。

2、详细的筛选过程（图1）如下：

步骤1：取1nmolssdna文库链和5nmol的互补链在250μlpbs（0.1m）缓冲溶液中95℃，5min后室温放置1h；

步骤2：取200μl链霉亲和素琼脂糖球至微型分离柱，用pbs（200μl/次）将分离柱中的链霉亲和素琼脂糖球洗三次，随后将加热变性后的混合物加至微型分离柱中，并与链霉亲和素琼脂糖球在室温孵育10min，10min后收集流出液，并将流出液再次与分离柱中的链霉亲和素琼脂糖球进行孵育，该过程共重复3次；

步骤3：用pbs（200μl/次）将分离柱中的链霉亲和素琼脂糖球洗10次；

步骤4：加入250μl，100μm的mtx到分离柱中，孵育30min后收集流出液，将流出液再次加入分离柱中孵育，该过程总共进行3次；

步骤5：收集步骤4中最后的流出液，进行pcr扩增，具体的pcr过程如下：1cycleof95℃，2min；15cyclesof[95℃，15s；60℃，30s；72℃，45s],and1cycleof72℃；

步骤6：收集pcr反应液，用3kmwco超滤管浓缩成20μl终体积；

步骤7：取200μl链霉亲和素琼脂糖球到微型分离柱中，并用pbs（200μl/次）洗3次；

步骤8：将浓缩后的pcr产物加到步骤7处理后的分离柱中并孵育10min。10min后收集流出液并重新加到分离柱中孵育10min，该过程总共进行3次；

步骤9：用pbs（200μl/次）洗10次后加入200μl,0.1mnaoh。收集流出液，并用300μl,0.1mhcl中和流出液；

步骤10：最后用nanodrop定量第一轮结束后得到的单链，将该单链溶液作为下一轮筛选的单链文库；

步骤11：重复步骤1-步骤10，其中，可通过减少每一轮初始的ssdna量，加入反筛物质，减少mtx孵育的时间及用量来增加筛选压力；

步骤12：经过18轮筛选后，对pcr产物进行克隆测序，得到重复率最高的序列hmx72。

3、测序后的核酸序列通过nupack软件，得到预测的核酸适配体二级结构，如图2a。

4、核酸适配体序列的优化：为了进一步降低成本及便于后期应用，将hmx72进行截短突变优化（如图2b），并考察优化截短突变序列hmx38t、hmx38、hmx32、hmx24、g12t、g16t、slat与甲氨蝶呤的亲和力。通过等温滴定量热法（itc）测定甲氨蝶呤与核酸适配体的结合解离常数（如图3）。甲氨蝶呤和核酸适配体均用含5mmmgcl2的pbs进行溶解。itc测试前，10000rpm转速离心10min保证除去溶液中的气泡。取400μl、1μm的核酸适配体加入样品池；60μl，30μmmtx加到注射器中。利用origin软件对单位点结合模型的滴定曲线进行拟合，得到结合常数kd。其中，图3a是全长序列hmx72的kd，为193±63nm，将hmx72的3’端和5’端剪短至序列hmx38t，得到的kd为326±132nm，如图3b。为了提高hmx38t稳定性，将序列hmx38t的茎上的两个g-t碱基对换成a-t，得到hmx38，其kd为165±82.5nm，如图3c。为了探究序列进一步的截短可能性，随后将hmx38的3’端和5’端依次截短三对和七对碱基，分别得到序列hmx32和hmx24，两者的kd分别为488±234nm、529±153nm，如图3d和3e。而将第12个碱基的g突变为t（g12t），或者将sl处的g-c突变为a-t（slat）时，与甲氨蝶呤均没有结合，如图3f和3h。在将第16个碱基g突变为t（g16t）时，虽与甲氨蝶呤有结合，但其结合能力弱，如图3g。因此与甲氨蝶呤有高亲和力的核酸适配体为hmx38。

实施例2：链置换生物传感器的建立。

合成5’端fam标记的fam-hmx38（fam-ctctcgggcgaacgcgggatgtttgggggacccacgttcgccc）序列，3’端bhq1标记的cap38-bhq1（cgttcgcccgagag-bhq1）dna序列。

合成的dna粉末均溶解于pbs中，用nanodrop定量至10μm。取10μlfam-hmx38（终浓度为2μm）、30μlcap38-bhq1（终浓度为6μm）及10μlpbs，在95℃加热5min后室温放置1h。cap38-bhq1能与fam-hmx38的5’端互补配对形成链置换生物传感器38-3（终浓度2μm，此浓度以fam-hmx38为标准），如图4。在上述传感器38-3（终浓度0.1μm）中，加入不同浓度的mtx（0μm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、1μm、2μm），室温反应30min后，用酶标仪测其荧光值（激发波长：480nm，发射波长：520nm）。因fam-hmx38能识别并结合mtx，释放出互补链cap38-bhq1，诱导fam的荧光恢复（图5）。

序列表

华东师范大学

一种甲氨蝶呤的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其应用

2021-05-24

5

siposequencelisting1.0

1

72

dna

人工序列(artificialsequence)

1

ggaggctctcgggacgacggacgcgggatgtttgggggacccacgtttgtcgtcccgatg60

ctgcaatcgtaa72

2

38

dna

人工序列(artificialsequence)

2

cgacggacgcgggatgtttgggggacccacgtttgtcg38

3

38

dna

人工序列(artificialsequence)

3

gggcgaacgcgggatgtttgggggacccacgttcgccc38

4

32

dna

人工序列(artificialsequence)

4

cgaacgcgggatgtttgggggacccacgttcg32

5

24

dna

人工序列(artificialsequence)

5

cgcgggatgtttgggggacccacg24

序列表

华东师范大学

一种甲氨蝶呤的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其应用

2021-05-24

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siposequencelisting1.0

1

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dna

人工序列(artificialsequence)

1

ggaggctctcgggacgacggacgcgggatgtttgggggacccacgtttgtcgtcccgatg60

ctgcaatcgtaa72

2

38

dna

人工序列(artificialsequence)

2

cgacggacgcgggatgtttgggggacccacgtttgtcg38

3

38

dna

人工序列(artificialsequence)

3

gggcgaacgcgggatgtttgggggacccacgttcgccc38

4

32

dna

人工序列(artificialsequence)

4

cgaacgcgggatgtttgggggacccacgttcg32

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dna

人工序列(artificialsequence)

5

cgcgggatgtttgggggacccacg24