拟南芥AP2σ参与网格蛋白介导的内吞和生长发育的研究

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摘要：

网格蛋白介导的内吞作为物质进入细胞的一种主要方式,它通过调节细胞膜表面受体活性参与多种信号转导过程.因此,网格蛋白介导的内吞对高等真核生物的生命活动是至关重要的.植物细胞膜表面存在大量受体蛋白,近年来的研究表明网格蛋白介导的内吞通过调节这些受体蛋白的功能参与植物激素信号转导以及对外界刺激的应答.然而,植物细胞中网格蛋白介导的内吞的分子机制及其在植物生长发育过程中的功能还知之甚少.本论文以拟南芥(Arabidopsisthaliana)为研究材料,利用遗传学,分子生物学和细胞生物学的方法对拟南芥AP2σ的功能进行了分析. 我们克隆了拟南芥AP2σ基因,构建了内源启动子驱动的EGFP标记的AP2σ融合蛋白稳定表达载体,并获得了AP2σ-EGFP转基因拟南芥植株.通过激光共聚焦显微镜的观察发现AP2σ-EGFP在拟南芥的根,胚轴以及叶中均有表达,且主要定位于细胞膜和细胞质中.通过荧光漂白后恢复技术分析表明,AP2σ-EGFP能够直接从细胞质中被招募到细胞膜上. ap2σ杂合突变体的生长发育与野生型无明显差异,但ap2σ纯合突变体在生长发育过程中表现出许多缺陷.值得注意的是,ap2σ突变体胚胎发育异常.通过对生长素报告基因DR5∷GFP的观察发现,生长素在ap2σ突变体中的分布发生改变.19.6%的ap2σ突变体子叶形成发生缺陷,形成单个子叶,融合子叶以及三个子叶.这些异常子叶的发生同时伴随着叶脉发育的紊乱,产生不闭合的叶脉网络结构.此外,ap2σ突变体还表现出侏儒的表型,即生长矮小且育性也显著降低.将内源启动子驱动的AP2σ-EGFP融合蛋白表达载体整合到ap2σ突变体中,能够互补纯合突变体生长发育中的各种缺陷. 为了进一步研究AP2σ的功能,我们分析了囊泡转运的荧光标记染料FM4-64在ap2σ突变体中的内吞速率.结果发现,FM4-64在ap2σ突变体中的内吞速率显著降低.在野生型中,染色5分钟后,FM4-64标记的内吞囊泡在细胞质中明显可见;染色25分钟后,超过80%野生型细胞中含有10个以上FM4-64标记的内吞囊泡.而在ap2σ突变体中,染色25分钟后,只有较少的细胞中含有FM4-64标记的囊泡.染色90分钟后,ap2σ突变体细胞中FM4-64标记的囊泡与野生型相比仍然较少.我们进一步检测了功能互补突变体中FM4-64内吞的速率,结果发现FM4-64内吞的缺陷在功能互补突变体中得到了恢复.进一步的分析发现,生长素转运蛋白PIN1在ap2σ突变体中的极性定位及内吞循环也受到了影响. PPI(protein proximity index)分析发现,AP2σ-mCherry与CLC-EGFP具有较高程度的共定位.免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)和荧光互相关光谱(fluorescence cross-correlation spectroscopy, FCCS)结果表明,AP2σ-mCherry和CLC-EGFP在活体内能相互作用.可变角度全内反射荧光显微术(variable-angletotal internal reflection fluorescence microscopy, VA-TIRFM)观察显示,AP2σ-EGFP在细胞膜上形成衍射极限内的荧光点,且这些荧光点与CLC-EGFP形成的荧光点表现出相似的动态.双通道VA-TIRFM观测表明,AP2σ-mCherry在内吞过程中聚集到CLC-EGFP标记的网格蛋白包被小窝中(clathrin-coated pits,CCP).时间序列成像(time-course analysis)和kymograph分析发现,AP2σ-mCherry荧光点的出现和消失比CLC-EGFP荧光点早,暗示AP2σ参与网格蛋白的招募中过程. 为了深入研究AP2σ在网格蛋白介导的内吞中的功能,我们还分析了ap2σ突变体背景下CLC-EGFP的定位及动态变化.结果发现,在ap2σ突变体中,CLC-EGFP在细胞质和反面高尔基体管网(trans-Golgi network, TGN)的定位没有明显变化,但其在细胞膜上的定位显著降低.VA-TIRFM动态分析发现,在ap2σ突变体中CLC-EGFP荧光点的密度明显降低.在野生型细胞中,CLC-EGFP荧光点在细胞膜上的密度为0.65±0.13μm2;而在ap2σ突变体中,它的密度只有0.38±0.05μm2.由于CCP在细胞膜上存在的时间会影响其在细胞膜上的密度,我们进一步对CLC-EGFP荧光点出现和消失的频率进行了分析.结果发现与野生型相比,ap2σ突变体细胞中CLC-EGFP荧光点出现和消失的频率都显著降低.透射电子显微镜观察表明,在ap2σ突变体中,细胞膜表面网格蛋白包被囊泡形成的频率也显著降低,进一步证明AP2σ参与网格蛋白包被囊泡的形成. 综上所述,利用遗传学手段和高时空分辨率的荧光成像技术研究,发现:(1)AP2σ调控植物生长发育的多个过程;(2) AP2σ调节生长素转运蛋白PIN1的内吞循环和极性定位;(3) AP2σ参与拟南芥网格蛋白介导的内吞过程,并在网格蛋白包被囊泡的成核和形成过程中发挥重要作用.本研究揭示了拟南芥AP2σ在植物网格蛋白介导的内吞途径的分子机制,为进一步开展内吞在植物生长发育过程中的功能研究奠定基础.

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关键词：

拟南芥 AP2σ基因 网格蛋白 内吞 生长发育 荧光互相关光谱

年份：

2015