第83期：p53缺失的结肠癌细胞基因组和转录组分析鉴定潜在的新耐药机制

讨论

在本研究中以结肠癌细胞系HCT116 p53+/+和具有TP53缺失的耐药HCT116p53-亚系为模型，旨在鉴定新的耐药基因。通过RNA测序、mFISH和aCGH鉴定基因表达谱、信号通路、生物学功能和染色体异常，一些已知参与耐药的基因被解除调控，支持HCT116 p53−细胞的多因子耐药表型，这些基因在各种耐药簇中被鉴定，包括凋亡、DNA修复、铁下垂、谷胱甘肽相关、热休克、氧化应激，补充表2中列出的转录因子可能对MDR表型有重要影响。

最上调的基因RND3/RhoE（+235.6倍）以前与肿瘤的侵袭、转移有关，并被报道为肿瘤耐药的潜在标志物胃癌以及结直肠癌病例的复发和预后。CARD11突变与伊布替尼有关。CARD11（−7.4倍）出现在前五大生物学功能的基因列表中，表明细胞凋亡抑制下调CARD11可能在HCT116p53−细胞的耐药表型中起重要作用。据报道，CARD11对癌症中的伊布替尼耐药有贡献，即CARD11可能在HCT116p53−/−细胞的耐药表型中发挥作用。据报道，DCLK1（+60.2倍）与非小细胞肺癌细胞对顺铂的耐药相关，miR539靶向DCLK1导致对顺铂的敏感性增加。DCLK1也与结直肠癌、胰腺癌和肾癌的耐药性相关。据报道，LBH（+31.9倍）是肝细胞癌的潜在标志物，因为其过度表达与不良预后相关。Myb（+28.9倍表达于敲除细胞）是一种致癌转录因子，在促进白血病细胞转化中发挥作用。Myb与结肠癌细胞的顺铂耐药性有关。它还参与一些实体瘤的发展和进展，包括黑色素瘤TACSTD2的缺失通过抑制化疗药物诱导的细胞凋亡促进鳞癌的进展和耐药性，这意味着TACSTD2可以作为鳞状细胞癌病理分级的标志物（图1表2与野生型HCT116 p53+/+细胞相比，HCT116 p53-细胞中参与经典耐药机制的解除调控基因（阈值：±7倍变化表达）差异表达（倍变化）DNA修复XRCC211.200 BRIP1 7.711氧化应激NCF215.131 MB−8.093转录因子MYB 28.855 NFATC4−7.619 。在HCT116 p53−/−细胞中下调110.1倍，指出TACSTD2下调可能是导致HCT116 p53−/−细胞侵袭性生长和多药耐药的机制。NRIP1下调后，食管鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭能力增强。本文观察到NRIP1在HCT116p53−细胞中下调81.5倍，这意味着NRIP1下调可能在多药耐药表型中发挥作用。HLA-DMB（−69.7倍）属于主要的组织相容性复合体II类基因，晚期浆液性卵巢癌中，HLA-DMB的高表达通过增加CD8淋巴细胞数量与较高的生存率相关。HLADMB的下调可能通过影响肿瘤侵袭性与HCT116 p53−细胞的MDR表型有关。 

MYB转录因子的过度表达（+28.8倍于敲除细胞的表达）与不良预后相关，并且经常在结直肠癌（CRC）中观察到。另一项研究指出，MYB在肿瘤细胞中的表达由于其致瘤作用而调节宿主免疫反应，这有可能影响CRC患者免疫治疗的使用。MYC（+5.1倍）是另一种在肿瘤发生中起关键作用的转录因子。它调节细胞周期相关基因的表达，并且在各种癌症类型中观察到过表达，包括结肠癌。

本实验已经在HCT116 p53−细胞中确定了最受影响的信号通路中的IL4信号通路，这意味着免疫应答通路可能影响耐药性。一项研究表明，IL-4可增强BCR信号传导，降低BCR激酶抑制剂（如伊布替尼）在CLL细胞中的有效性。另一项研究报告，通过白细胞介素-1受体相关激酶1和4（IRAK1/4）复合物激活先天免疫途径有助于FLT3突变AML细胞的适应性抵抗。这一结果支持我们观察到的免疫应答途径与耐药性的关系。

RNA-seq结果通过westernblotting对ANGPT2和过氧化氢酶进行验证。与HCT116 p53-+/+细胞相比，在HCT116 p53-/-细胞中，angpt2mrna上调，而CAT mRNA下调。蛋白表达证实了这一点。CAT在肿瘤中经常下调，例如，乳腺癌的特点是过氧化氢酶下调并伴随SOD过度表达。另一方面，ANGPT2的上调与结肠癌的肝转移有关。

网络分析指出，网络1的“癌症”、“机体损伤与异常”、“细胞组装与组织”、“分子运输”网络2的“机体损伤与异常”、“碳水化合物代谢”网络3为主要影响因素功能。由于TP53缺失，DNA修复和凋亡机制的破坏可能导致细胞和组织结构的异常，最终增加了肿瘤的发生和发展潜力。在网络1中，编码组蛋白H4、细胞周期蛋白A和NFκB的基因具有最高的结点数。CD3和HSP70在网络2的中心有最多的节点，这意味着细胞周期调控的影响炎症和热休克反应对耐药性的影响。重要的是，网络2中分子转运基因的出现强调了p53和细胞转运蛋白之间可能存在的相互作用，从而促进癌细胞的MDR。ABC转运蛋白的一个成员ABCB1/MDR1基因在转录上依赖于p53，其中野生型p53通过序列特异性结合下游启动子对ABCB1/MDR1基因表达产生负面影响。相反，突变型p53在不同细胞系中激活ABCB1/MDR1启动子。ERK1/2基因在网络3中具有最高的节点数，表明ERK调控的细胞增殖途径对耐药性的贡献。    

NFκB与PI3K和HSP70一起位于融合网络的中心，这意味着炎症途径以及细胞周期和热休克反应在MDR表型中的作用。Th1、Th2通路和CD28信号通路是HCT116-p53-细胞中最受影响的信号通路之一，支持炎症通路在MDR表型中起重要作用的假说。

结论

总的来说，通过RNA测序、mFISH和aCGH分析结肠癌细胞系HCT116 p53和HCT116p53 +/+的基因表达谱，以比较的方式鉴定差异表达的基因、受影响的蛋白质网络、途径、生物学功能以及染色体畸变。发现了多种基因、途径和网络，它们可能与结肠癌的耐药性和侵袭性行为有关。这项研究清楚地表明，TP53敲除细胞的耐药性是由多个因素决定的，而不是由单个因素决定的。显然，多因素耐药性使新治疗策略的开发变得复杂。然而本研究可能代表了一个设计更具体和更有前途的绕过耐药性的抗癌策略的起点。