流式细胞术检测细胞周期

流式细胞术可用于细胞周期流式结果分析，以检测特定细胞群中处于细胞周期不同阶段的百分比，也可搭配其他试剂，仅分析S期。使用流式细胞术检测细胞周期并进行结果分析时，可选择活细胞或固定细胞试剂。

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当用细胞周期试剂染色时，细胞中的 DNA 会以化学计量方式结合染料，也就是说染料结合量与每个细胞中存在的 DNA 量成比例。分布在细胞周期各个阶段的DNA含量直方图是根据流式细胞周期检测结果分析中的细胞数量与线性荧光数据得到的（图 1A）。然后可以使用现有的标准模型来确定特定细胞群中哪些细胞处于 G0/G1 期与 S 期、G2 或多倍体状态（图 1B）。

或者，可以使用双重标记实验在固定细胞中检测 S 期：先用 EdU（胸苷类似物）标记增殖细胞的 DNA 、用 Click-iT EdU 检测法检测，然后用 DNA 染料（如FxCycle 染料）染色（图 2）。该方法可以更准确地定量 S 期，因为胸苷类似物会选择性地结合到活跃分裂细胞的 DNA 中。

图 1.流式细胞周期检测结果分析得到的DNA含量分布。(A)使用Vybrant DyeCycle Violet 染料对活 Jurkat 细胞染色得到的DNA含量分布直方图。G0/G1 和 G2/M 期的DNA含量峰值中间为 S 期DNA含量的分布。激发波长为 Violet 405 nm （440 nm 带通滤波器）。(B) 基于线性荧光和化学计量染色的 DNA 分布模式图。G2M 期 4N 细胞的荧光值是 G0/G1 期 2N 细胞的两倍。

图2.使用 FxCycle Violet Ready Flow 试剂和 Invitrogen Click-iT EdU Alexa Fluor 647 流式细胞分析试剂盒进行细胞周期流式结果分析。先用 10 µM EdU 处理 Jurkat 细胞（人 T 细胞白血病细胞系） 2 小时，再使用 Alexa Fluor 647 叠氮化物检测。随后加入 2 滴 FxCycle Violet Ready Flow 试剂进行细胞染色，并在 25°C 下孵育 30 分钟。最后使用 405 nm 激光和 440/50 nm 发射滤光片在 Invitrogen Attune NxT 流式细胞仪上采集数据。细胞群分析结果如下：凋亡的亚 G1 期细胞占比 3.4%， G0/G1 期细胞占比 49.1%， S 期细胞占比 33.0%，G2M 期细胞占比 14.0%。

我们提供用于细胞周期流式结果分析的经典细胞周期 DNA 染料，例如 Hoechst 33342 和 DRAQ5，但在使用这些染料做实验时必须考虑到它们的限制因素（请参阅活细胞周期染料选择指南），这也是我们开发用于活细胞周期分析的 Invitrogen Vybrant DyeCycle 染料的原因。

图 3.分选后细胞生长状况的明场图像。用 5 µM 可 UV 激发的 Hoechst 33342、5 µM Vybrant DyeCycle Ruby 染料或 5 µM DRAQ5 DNA 染料进行 Jurkat 活细胞染色。细胞分选后培养 8 天，以检测细胞在染色和分选后的生长能力。据观察：与对照细胞相似，Hoechst 33342 和 Vybrant DyeCycle Ruby 染料染色后的 Jurkat 细胞具有特征性的葡萄状细胞群落。用 DRAQ5 染料染色的细胞没有明显的生长，表明该染料具有高水平的细胞毒性。

图 5.多参数细胞周期和免疫表型分析。 TF-1 成红细胞用酒精固定过夜，洗涤后重悬在 0.1% Triton X-100/PBS/1% BSA 中，然后用抗组蛋白 H3[pS10] 抗体（Zenon Alexa Fluor 488 Rabbit IgG 标记试剂标记）和 FxCycle Violet 染料进行染色。pH3阳性细胞群（红色）为处于有丝分裂中的细胞。

图 6.用 SYTOX AADvanced 死细胞染色试剂盒对混合的 Jurkat 细胞群进行染色，并使用用流式细胞仪进行分析。用 1 uM SYTOX AADvanced 死细胞染色试剂盒对热杀和未处理的 Jurkat 混合细胞染色 5 分钟。在配备有 488 nm 激光器和 695/40 nm 带通滤波器的流式细胞仪上分析细胞。活细胞很容易从死细胞群中区分出来。

图 7.FxCycle PI/RNase 染料染色的 Jurkat 细胞直方图显示 DNA 含量分布。将 Jurkat 细胞在 70% 乙醇中固定，洗涤，然后重悬于 FxCycle PI/RNase 染料中，室温孵育 30 分钟。G0/G1 和 G2/M 期的DNA含量峰值中间为 S 期DNA含量的分布。使用 532 nm 激发（585/42 nm 带通滤波器）进行分析。

图 8.FxCycle Far Red 染料染色后的的 TF-1 成红细胞直方图显示 DNA 含量分布。TF-1 细胞用酒精固定过夜，洗涤，然后重悬于 0.1% Triton X-100/PBS/1% BSA 中，然后在室温下用 FxCycle Far Red 染料加 RNase A 染色 30 分钟。G0/G1 和 G2/M 期的DNA含量峰值中间为 S 期DNA含量的分布。使用 633 nm 激发（660/20 nm 带通滤波器）进行分析。