CD19 CAR

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探讨CD19 CAR-T细胞培养过程中其PD-1蛋白、mRNA水平及细胞杀伤活性变化。

收集6例外周血PD-1高表达恶性淋巴瘤患者、6例健康志愿者的外周血T细胞，作为CAR-T培养的T细胞来源。流式细胞术检测PD-1蛋白表达、PCR法检测PD-1 mRNA水平，CCK-8法检测细胞增殖，LDH法检测细胞杀伤活性。

①PD-1高表达患者T细胞来源CD19 CAR-T细胞，与志愿者T细胞来源者相比，转染率无差异（P>0.05）；②PD-1高表达T细胞来源CAR-T细胞与PD-1抑制剂联合与否，以及健康志愿者CAR-T之间，细胞增殖差异无统计学意义（P>0.05）；③PD-1高表达T细胞与CAR-T细胞对淋巴瘤细胞株杀伤活性，低于二者联合PD-1抑制剂及志愿者CAR-T细胞（P0.05）；④各组细胞培养过程中PD-1表达均下降，差异无统计学意义（P>0.05），但各组细胞培养过程中，PD-1 mRNA的变化差异无统计学意义（P>0.05）；⑤PD-1高表达T细胞来源CAR-T收获后，与PD-1抑制剂共培养与否，其PD-1表达差异无统计学意义（P>0.05），但CAR-T与淋巴瘤细胞株接触后，其PD-1表达随培养时间延长而增高，加入PD-1抑制剂可拮抗该作用；各组间PD-1 mRNA的变化差异无统计学意义（P>0.05）。

PD-1高表达T细胞来源CAR-T细胞与肿瘤细胞接触后，其PD-1表达随培养时间延长而增高；而包括PD-1抑制剂在内，不能改变其PD-1 mRNA的表达。

To observe the changes of PD-1 expression, mRNA level and cytotoxic activity of CD19 CAR-T cells during the culture process of CAR-T cells.

The peripheral blood T cells of 6 lymphoma patients with high expression of PD-1 and 6 healthy volunteers were the source of CAR-T cells. The expression of PD-1 was analyzed by flow cytometry. The mRNA level of PD-1 was analyzed by PCR. The cell proliferation was analyzed by CCK-8 assay. The cytotoxicity was analyzed by LDH assay.

①The transfection efficiency of high PD-1 expression T cells and healthy volunteer T cells were as the same (P>0.05). ②The cell proliferation capacity of CD19 CAR-T cells from high PD-1 expression T cells or healthy volunteer T cells, with or without PD-1 inhibitor were as the same (P>0.05). ③The cytotoxicity to lymphoma cells of high PD-1 expression T cells and CAR-T cells were lower than that of these two T cells combined with PD-1 inhibitor and the CAR-T cells from healthy volunteer T cells (P0.05). ④There was no difference of the expression of PD-1 in all CAR-T cell groups during the culture process (P>0.05). There was no difference of mRNA level of PD-1 in all groups during the culture process (P>0.05). ⑤The PD-1 expression of CAR-T cells increased by the time of culture after contacting with lymphoma cells (P0.05).

The PD-1 expression of CAR-T cells from high PD-1 expression T cells increased by the time of culture after contacting with lymphoma cells. However, the mRNA level of PD-1 of all groups did not change, even if PD-1 inhibitor was applied.

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗通过整合CAR-T细胞特异性识别并结合肿瘤相关抗原靶点，传递信号至细胞内，引起T细胞增殖活化，从而靶向杀伤肿瘤细胞[1]。研究表明程序性死亡因子1（PD-1）途径的存在削弱了CAR-T细胞治疗效果，通过PD-1抑制剂进行抗体阻断可提高CAR-T细胞的杀伤活性及持久性[2]。本研究我们通过CD19 CAR-T细胞与PD-1抑制剂共培养，检测PD-1蛋白、mRNA水平及细胞增殖率变化，探讨CD19 CAR-T细胞联合PD-1抑制剂对淋巴瘤细胞株的杀伤活性的影响。

1．细胞及主要试剂：人肾上皮细胞系293T细胞、弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株Raji细胞均购自美国模式培养物集存库（ATCC），大肠杆菌感受态细胞株DH5α购自宝生物工程（大连）有限公司。无内毒素质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。Lenti-Pac慢病毒颗粒包装试剂盒购自上海伯易生物科技有限公司。磁珠分选试剂盒购自德国美天旎生物技术有限公司。CARTEST-19检测试剂盒购自上海近岸科技有限公司。LDH细胞毒性检测试剂盒、ELISA检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。PD-1-PE抗体购自美国BD公司。CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒购自日本同仁化学研究所。第二代抗CD19质粒购自美国Creative Biolabs公司。PD-1抑制剂Nivolumab购自美国百时美施贵宝公司。

2．质粒转化、扩增、提取：大肠杆菌感受态细胞株DH5α置于冰上解冻，加入第二代（共刺激分子为CD28）抗CD19 CAR质粒，冰中放置30 min，42 °C放置30~60 s，再次置于冰中2~3 min。加入37 °C预温的SOC培养基，振荡培养。取适量上述菌液，三区划菌，37 °C过夜培养后挑取单个白色菌落，放入SOC培养基中，37 °C振荡培养。取500 µl培养后的菌液加入SOC培养基中，37 °C振荡培养。采用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒后进行定量。

3．CD19 CAR-T细胞制备及检测：收集6例外周血PD-1高表达恶性淋巴瘤患者、6例健康志愿者的外周血标本，作为本实验CAR-T培养的T细胞来源。研究经我院伦理委员会批准，标本的采集经所有研究对象知情同意并签署知情同意书。淋巴细胞分离液提取单个核细胞，磁珠分选试剂盒从提取的单个核细胞中富集CD3+ T细胞。获得的细胞用含有IL-2、谷氨酰胺的T细胞专用培养基培养，培养第4天接种慢病毒，培养第12天收获CAR-T细胞。对照组T细胞不进行慢病毒接种，同样第12天收获细胞。按CARTEST-19检测试剂盒说明书进行操作，上流式细胞仪检测CD19 CAR-T细胞的转染效率。同时收获培养第0、4、8、12天各组细胞，流式细胞仪检测各组细胞PD-1蛋白水平，PCR检测各组细胞PD-1 mRNA水平（上游引物：5′-CCAGGATGGTTCTTAGACTCCC-3′，下游引物：5′-TTTAGCACGAAGCTCTCCGAT-3′），实验均重复3次。

4．PD-1抑制剂共培养：取培养第12天PD-1高表达患者来源T细胞、PD-1高表达患者CD19 CAR-T细胞、健康志愿者CD19 CAR-T细胞，加入终浓度72 mg/L的Nivolumab共培养72 h，分别设为PD-1高表达T细胞+PD-1抑制剂组、PD-1高表达CD19 CAR-T细胞+PD-1抑制剂组、健康对照CD19 CAR-T细胞+PD-1抑制剂组。

5．CD19 CAR-T细胞体外增殖能力的检测：取PD-1高表达患者及健康志愿者CD19 CAR-T细胞及其与PD-1抑制剂共培养组，于含10%FBS的RPMI 1640培养基，37 °C、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。按CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒说明书进行操作，培养0、24、48 h时采用酶标仪检测450 nm处吸光度（A）值，计算其增殖能力。每组设3个复孔，实验重复3次。

6．体外杀伤活性的检测：以Raji细胞为靶细胞（细胞计数为2×105），分别以各组T细胞为效应细胞进行实验，效靶比设为2∶1。按LDH细胞毒性检测试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪检测490 nm处A值，计算其杀伤率。每组设3个复孔，实验重复3次。

7．统计学处理：采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，两组间比较采用独立样本的t检验，各时点的组间比较行单因素方差分析，两两比较采用q检验，双侧POpen in a separate window图1PD-1抑制剂对CD19 CAR-T细胞增殖能力的影响

CAR-T细胞：嵌合抗原受体T细胞

3．对淋巴瘤细胞株的体外杀伤活性比较：效靶细胞共培养0、24、48 h，检测对靶细胞的杀伤活性。在48 h时，方差分析显示各组比较差异有统计学意义（F=6.036；P=0.007）。PD-1高表达CD19 CAR-T细胞+PD-1抑制剂组与健康志愿者CD19 CAR-T杀伤活性比较差异无统计学意义[（71.61±7.50）%对（79.73±9.01）%，P=0.153]；PD-1高表达CD19 CAR-T细胞+PD-1抑制剂组杀伤活性高于PD-1高表达T细胞+PD-1抑制剂组[（26.33±4.11）%，P=0.003]和PD-1高表达CD19 CAR-T组[（6.77±1.26）%，P0.05）（图2）。

CAR-T细胞：嵌合抗原受体T细胞；1：PD-1高表达患者T细胞培养组；2：PD-1高表达患者T细胞+ PD-1抑制剂共培养组；3：PD-1高表达患者CAR-T细胞培养组；4：PD-1高表达患者CAR-T细胞+ PD-1抑制剂共培养组；5：健康志愿者T细胞培养组；6：健康供者CAR-T细胞培养组

6．CD19 CAR-T细胞与淋巴瘤细胞接触后的PD-1表达变化：在96 h时，方差分析显示各组比较差异有统计学意义（F=8.527，P=0.001）。PD-1高表达T细胞来源CD19 CAR-T收获后，与PD-1抑制剂共培养与否，其PD-1表达无统计学意义（P=0.681）；但与Raji细胞共培养（效靶比为1∶2）后，其PD-1表达随时间延长而上升，与CAR-T组比较差异具有统计学意义（P