【研发】浅谈细胞培养代谢副产物

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乳酸和铵是细胞培养过程中不可避免的两种代谢副产物，两者的累积都是不想看到的，因为这两种代谢副产物积累会影响到细胞生长、蛋白产量和质量等。文中笔者对乳酸和铵影响细胞生长的缘由，以及如何降低两者的细胞毒性进行了简要概述。

乳酸

CHO细胞培养前期往往有少量的乳酸积累，特别是在细胞代谢旺盛的对数生长期，一般情况下细胞都可以将这些乳酸代谢消耗掉。但有时这对于某些细胞株并不顺利，乳酸的累积对细胞是致命的。乳酸主要来源于葡萄糖的不完全氧化，乳酸的累积会使体系pH降低，为使pH回升添加的碱液往往会增加体系的渗透压，从而影响细胞正常生长代谢。而如果不加碱液调节pH，低pH环境对于细胞体内的酶不是个好消息，酶活的降低会限制细胞代谢，影响细胞生长。

为解除乳酸对细胞生长及蛋白产量的影响，可以考虑构建对环境压力耐受性高的细胞株，也可对细胞培养策略进行优化。用代谢缓慢的糖类代替葡萄糖作为碳源可以降低乳酸的累积，如半乳糖、岩藻糖和麦芽糖的使用。而当乳酸有一定累积时，可以通过葡萄糖的浓度来改变细胞的代谢路径，改葡萄糖代谢为乳酸代谢，从而减少乳酸累积，但低糖消耗乳酸的策略对蛋白质量的影响并不明确。对细胞进行基因改造也可以降低乳酸累积，如删除乳酸脱氢酶（LDH）基因、扩增丙酮酸羧化酶（PYC2）基因等。其中LDH是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶，PYC2是参与将乳酸、丙酮酸、氨基酸及甘油转化生成葡萄糖的催化酶，对两者的基因改造可在代谢通路减少乳酸累积。

上述的方法虽然可降低乳酸累积，但操作性不强。笔者认为，铜离子（Gu2+）的添加是目前为止降低乳酸累积的最佳方法，除去Gu2+抑制乳酸累积的作用，许多研究中都提到Gu2+对细胞的生长具有促进作用。Luo等就研究了不同浓度的Gu2+对细胞生长、乳酸累积和蛋白产量的影响，如图1所示，培养至第五天时，细胞表现开始出现差异，高浓度Gu2+实验组细胞密度继续增加、乳酸开始消耗；而低浓度Gu2+实验组的乳酸一直在累积，开始显现出对细胞的抑制作用；从蛋白产量看，高浓度Gu2+实验组的蛋白浓度要高些，可知Gu2+的添加可促进细胞对乳酸的消耗及细胞生长。值得注意的是，Gu2+的添加会影响到单抗的质量，如增加碱性峰的比例、降低高甘露糖型水平等。

图1 Gu2+浓度对细胞生长、乳酸累积及蛋白产量的影响

（图片来源于参考文献1）

铵

作为细胞培养过程中的另一代谢副产物，铵受到的关注远没有乳酸多，这是因为目前使用的CHO细胞中多采用的谷氨酰胺合成酶（GS）扩增系统，而GS细胞一般都可以利用铵来合成谷氨酰胺，因此关于降低铵累积对细胞毒性作用的研究较少。然而并不是所有的细胞系都是GS系统，还有二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase，DHFR）筛选系统等，因此对铵的毒性机理、降低累积的认识还是很有必要的，可以帮助我们更好的理解细胞培养过程。

体系中的铵主要来自于谷氨酰胺等的代谢降解和自发降解，其中自发降解只占很少一部分，大部分的铵都来自氨基酸如谷氨酰胺的代谢降解。正常情况下，培养体系中、细胞质内和线粒体的内铵（NH4+）和氨（NH3）是处于一种动态平衡下的，一定的pH时两者维持一定的浓度，同样两者的平衡也是维持细胞胞内pH稳定的重要条件。而当其中之一，如NH4+的浓度超出正常范围时，平衡被打破，进而引起胞内pH的变化，影响细胞代谢相关酶的活性，不利于细胞的正常生长与代谢。还有学者认为，由于铵本身就参与部分酶促反应，如谷氨酸和铵合成谷氨酰胺的反应、谷氨酸的进一步降解等，铵浓度的改变也会对此类代谢产生不可预估的影响。

由此可知，铵的累积会导致胞内pH失衡及酶活降低，进而影响细胞表现。此外，铵的累积还会对蛋白质量造成影响，主要表现在降低糖链末端的唾液酸化水平。高浓度铵水平下，α(2,3)-唾液酸转移酶和GMP-唾液酸转运蛋白水平都有一定降低，这不仅会导致胞液中唾液酸向高尔基体的转动量降低，还会影响糖链上的唾液酸连接，最终降低蛋白的唾液酸化。

根据铵的来源来降低是重要的策略，如采用不易自发降解的谷氨酰胺衍生物代替谷氨酰胺，以及使用谷氨酸代替谷氨酰胺添加到培养基中都是可以的方法。还有学者以氨基酸为出发点，研究了不同氨基酸对降低铵对细胞毒性的影响，最终得出苏氨酸（threonine）、脯氨酸（proline）和甘氨酸（glycine）可以抑制高浓度铵对细胞的毒性。如图2所示，同样高浓度NH4Cl的情况下，添加以上三种氨基酸实验组的细胞要高些。基因手段也可以降低铵的累积，例如删除乳酸脱氢酶（LDH）基因，有学者进行相关实验时发现LDH基因删除的实验组，其乳酸及铵累积均有一定的降低。另外，合理的谷氨酰胺和葡萄糖补料策略也是控制铵浓度的方法之一。

图2 氨基酸对高浓度铵离子添加培养基中细胞密度的影响

（图片来源于参考文献2）

参考文献

1. Comparative Metabolite Analysis to Understand Lactate Metabolism Shift in Chinese Hamster Ovary Cell Culture Process；

2. Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells。

作者简介：

知行，生物化工硕士，从事细胞培养方面的研究。工作之余密切关注国内外医药行业动态以及研究进展，用简单的语言讲述不简单的未来，一个不断前行的医药人。

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