B淋巴细胞活化因子抗体在自身免疫性疾病治疗中的研究进展

B淋巴细胞活化因子(B cell activating factor, BAFF) 属于肿瘤坏死因子超家族，也称为TNFSF13B (tumor necrosis factor superfamily 13B, TNFSF13B)、THANK (TNF homologue that activates apoptosis, NF-κB and JNK) 等[1]，是一种含有285个氨基酸的Ⅱ型跨膜蛋白，其主要由单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞等骨髓细胞以及生发中心(germinal left, GC) 内滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell, TFH) 产生，也可由放射抗性基质细胞、激活的T细胞、B细胞和某些骨髓非造血干细胞产生[2]。人源BAFF基因被定位到13q32-34号染色体上[3]。一般情况下，BAFF通过促进B淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2) 家族等抗凋亡基因的表达来介导B细胞存活[4]。BAFF过度分泌会促进B细胞转化并增强自身免疫[5]，因此，有必要调控其过度表达。研究BAFF和BAFF受体在人体系统中的作用，有助于开发治疗自身免疫性疾病的药物。

BAFF最初被鉴定为调控B细胞存活和成熟的因子[6]。BAFF受体属于TNF受体(TNF receptor, TNF R) 家族成员。它通过3种受体即：BAFF受体(BAFF receptor, BAFF R)、B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen, BCMA) 和跨膜激活剂和钙调节剂以及亲环素配体相互作用体(transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor, TACI) 发挥作用。膜结合BAFF需通过弗林蛋白酶切割才产生可溶性BAFF[7]。目前已知可溶性BAFF的生物学效价，但膜结合BAFF的生物学效价尚未明确[8]。可溶性BAFF以两种形式存在：同源三聚体(图 1) 或形成60聚体(20个三聚体的组装体，图 2)。在中性或碱性pH条件下，BAFF形成60聚体，而60聚体在酸性pH条件下不可逆地分解成三聚体。研究发现，60聚体的活性比三聚体高[9]。在BAFF 60聚体中存在一个DE环，是肿瘤坏死因子家族中BAFF所特有的，用于介导60聚体的形成[10]。BAFF三聚体可以结合BAFF R、增殖诱导配体(A proliferation-inducing ligand, APRIL) 和BCMA；而60聚体BAFF可以结合BAFF R、TACI，但与BCMA的亲和力较低。膜结合BAFF R和膜结合TACI可以通过解整合素样金属蛋白酶作用形成可溶形式[11-12]，而膜结合BCMA由γ-分泌酶处理后脱落为可溶性BCMA[13]。此外，还存在BAFF-APRIL异源三聚体(图 3) 和一种称为ΔBAFF的剪接变体。BAFF-APRIL异源三聚体与同型三聚体BAFF或APRIL相比，异源分子是B细胞增殖的弱效诱导剂[14]。ΔBAFF是一种由交替剪接的ΔBAFF mRNA亚型编码的小肽缺失的蛋白质，其作为拮抗剂，通过与全长BAFF异聚作用，抑制BAFF活性进而降低B细胞的活性[15-17]。

在BAFF基因敲除小鼠中，B细胞的发育在过渡型Ⅰ期(T1) 被阻断，具体表现为Ⅱ型(T2)、滤泡型(B2) 和边缘区B细胞的缺失，而骨髓B淋巴细胞生成、T1 B细胞、B1细胞和其他造血细胞谱系不受影响[21]。过度表达BAFF的转基因小鼠外周B细胞数量增加，造成高球蛋白血症并进一步发展为自身免疫病[22]。γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)、转化生长因子β (transforming growth factor-β, TGF-β) 和α-干扰素(interferon-α, IFN-α) 等多种细胞因子和雌激素均能上调BAFF的表达[23]。Idda等[24]研究证明了由核因子90 (nuclear factor 90, NF90) 介导的microRNA募集可以抑制BAFF翻译。研究发现，控制BAFF表达的位点位于IFN-α信号传导的下游，且BAFF的表达与干扰素调节因子家族的成员紧密相关[25]。若要调控BAFF的表达则需同时阻断多个不同的信号传导途径，因此在细胞水平上抑制BAFF的表达极其困难。

BAFF R是一种分子量为19 kDa的Ⅲ型跨膜蛋白[26]，目前已知的其唯一配体是BAFF。BAFF与BAFF R结合的亲和力比与BCMA结合的亲和力高100倍[10]。BAFF R广泛表达于除骨髓浆细胞以外的B细胞[5]。BAFF-BAFF R的相互作用可以诱导CD21和CD23的表达，从而促进成熟B细胞的存活[27]。边缘区B细胞的形成也明显依赖于BAFF R介导的信号[28-29]。人类BAFF R缺乏症的表现为循环B细胞极少，IgM和IgG血清浓度极低，但IgA水平正常或较高[30]。此外，BAFF R还介导小鼠体内循环T细胞与BAFF的共刺激效应[6]。BAFF诱导的BAFF-R信号主要是通过选择性NF-κB路径，也可能激活经典的NF-κB通路。NF-κB通路参与免疫系统的正常发育和生长，因此BAFF R的NF-κB结合位点可能是自身免疫性疾病的一个新的治疗靶点。

BCMA最初被鉴定为是具有组织特异性的第一个高尔基体驻留蛋白，其表达与B细胞的分化阶段有关[31]。BCMA主要表达于浆细胞[32-33]。BCMA是一种不含信号肽的Ⅲ型跨膜蛋白[34]。BCMA和BAFF R不同于其他TNF受体家族成员，它们具有一个富含半胱氨酸的结构域(cysteine-rich domain, CRD)，该结构域的作用是与BAFF或APRIL三聚体内的单个配体建立接触[35]。

对BCMA缺陷小鼠的分析显示，BCMA在正常的鼠B细胞稳态中不起作用；在无BCMA的情况下，易患狼疮的小鼠会发展为B细胞淋巴增生性疾病型和更严重的自身免疫表型小鼠[36]。Jiang等[37]研究报道了BCMA对TFH扩展负调节的重要性，T细胞中BCMA的缺乏促进了TFH扩展及GC的形成。

TACI首先在T细胞中发现，且能够结合钙调节剂和亲环素配体并随后激活转录因子NF-AT[38]，是一种高亲和力结合BAFF的Ⅲ型膜蛋白。TACI主要由所有成熟的外周B细胞表达，还可以在活化的T细胞上表达[38]。尽管TACI包含2个CRD，但只有第二个CRD是其与BAFF和APRIL高亲和力结合所必需的，因此TACI与APRIL和BAFF的相互作用模式与BCMA或BAFF R的基本相同[35]。与小鼠TACI相比，人类TACI基因经过选择性剪接产生不同亚型(TACI-S和TACI-L)。与TACI-L表达细胞或同时具有2种亚型的细胞相比，TACI-S结合配体BAFF和APRIL的亲和力更高[39]。

TACI的功能有两面性，正面驱动T细胞独立的免疫反应，促进T细胞依赖性和非依赖性的抗体分泌和浆细胞分化；负面下调B细胞的激活和扩张，促进B细胞凋亡，诱导B细胞中IgG和IgA的转换重组[40]。TACI的负面调节包括通过促进B细胞诱导的成熟蛋白1 (B lymphocyte induced maturation protein-1, Blimp-1) 表达来抑制B细胞增殖；通过抑制T细胞共刺激配体在GC B细胞上的表达来抑制GC反应和B细胞增殖[23]。

TACI的表达水平受多种因素调节并处于动态变化。激活Toll样受体(toll-like receptor, TLR)、CD40或B细胞抗原受体会上调B细胞中TACI的表达，而白细胞介素-21 (interleukin-21, IL-21) 下调了GC B细胞中的TACI表达[23]。适当水平的TACI信号传导可抑制过度自身免疫，维持机体免疫的平衡和耐受。

与大多数缺乏死亡域的TNF受体一样，BAFF与这些受体的结合会激活特定的TNF受体相关因子(TNF receptor associated factors, TRAFs)，该因子调节B细胞中的信号转导(图 4)[41-42]。

全身性自身免疫性疾病的病理学特征是由抗原组成的免疫复合物在各个器官引起严重的炎症。自身免疫性疾病具有复杂的病因，目前对病因的形成机理尚不清晰，但是已经认识到B细胞起着核心作用。尽管在过去的50年中，使用皮质类固醇及其他免疫抑制剂等常规疗法提高了自身免疫性疾病患者的生存率，但这些药物在某些患者中由于无效、不耐受或严重副作用而受到限制[44]。常规的免疫抑制剂是自身免疫性疾病治疗的基础，但是其缺乏特异性，同时影响机体正常的免疫答应。巯嘌呤类药物的代谢转化可以降低体内BAFF水平，从而抑制淋巴细胞增殖[45]。自身免疫性肝炎患者的BAFF水平随着皮质类固醇治疗而下降[46]。与正常人相比，红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)、干燥综合征(sjogren syndrome, SS) 或类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA) 患者的血清或滑液中BAFF水平升高。高水平的BAFF与自身抗体(SLE中的抗双链DNA抗体、原发性SS中的抗SSA抗体和RA中的类风湿因子) 的存在有关[47]。因此，BAFF及其受体是治疗自身免疫性疾病的关键靶点。以下总结与BAFF通路过度活化相关的疾病。

SLE是典型的系统性自身免疫性疾病，其特征是B、T细胞反应过度，对自身抗原失去免疫耐受，免疫复合物沉积并造成器官损害。SLE的发病机制与自身抗体的产生、凋亡残余物的清除、免疫复合物的组织沉积、补体的活化和细胞因子的过度分泌有关[48]。

研究发现，SLE患者血清中的BAFF与血沉率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)、C反应蛋白(C reactive protein, CRP)、抗dsDNA呈正相关，与补体C3、C4呈负相关(P < 0.001)；SLE患者B细胞BAFF R表达与BAFF水平呈负相关(P < 0.001)；BAFF R表达与系统性红斑狼疮疾病活动指数(SLE disease activity index, SLEDAI)、ESR、CRP、抗dsDNA活性呈负相关，与补体C3、C4呈正相关(P < 0.001)[49]。在系统性红斑狼疮患者中，BCMA水平与疾病活动指数密切相关[50]。

对BAFF在SLE发病中致病机理的研究发现，来自坏死或凋亡细胞的ssRNA或DNA，形成抗体-核酸免疫复合物。该复合物与免疫球蛋白Fcγ受体Ⅱa结合，从而激活TLR7和TLR9，并以自身免疫复合物的形式被浆细胞样树突状细胞内化，通过髓样分化初级反应蛋白(myeloid differentiation primary response protein MyD88, MyD88) 传递信号，并上调IFN-α的表达，进而促进BAFF产生[51]。在缺乏BAFF的情况下，过量表达的BAFF可提高自身反应性B细胞存活率，驱动自身免疫[51]。

SS是一种自身免疫性疾病，其特征是外分泌腺被破坏、自身抗体产生、免疫复合物沉积与许多器官淋巴细胞浸润相关的全身并发症[52]。临床上，SS的典型表现是口干症和干燥性角膜结膜炎，引起该病死亡率增加的主要原因是B细胞恶性淋巴增生[52]。SS可能单独发生，如原发性SS，或继发于其他自身免疫性疾病。

研究认为，在存在遗传易感性以及环境或激素触发的情况下，腺上皮细胞失调并释放趋化因子和黏附分子，这触发了树突状细胞和淋巴细胞到腺体的迁移；腺体中的树突状细胞产生高水平的干扰素，从而导致淋巴细胞在组织中进一步滞留并随后被激活；干扰素刺激上皮细胞，树突状细胞和T细胞产生BAFF，BAFF促进不规则B细胞成熟，导致自身免疫B细胞的形成，后者会局部分泌自身抗体[53]。研究表明，转基因BAFF小鼠会发展出类似于人类SS的自身免疫性涎腺炎，而SS患者显示出与自身抗体、高疾病活性(high disease activity, HDA) 和淋巴瘤发展相关的高血清BAFF水平或BAFF/BAFF R基因变异的情况[54]。

RA是一种常见的自身免疫性疾病，约占世界人口的0.5%–1.0%。这种疾病通常表现为手或脚的滑膜关节对称性多关节炎，进一步导致全身炎症和关节退行性病变，致使动脉粥样硬化风险增加，最终导致心血管疾病，甚至死亡[55]。B细胞通过发挥T细胞活化作用来促进疾病进程[56]。Bosello等[57]的数据表明，BAFF与IgM、类风湿因子以及抗环瓜氨酸肽自身抗体滴度(r=0.76和r=0.49；P < 0.000 01，P=0.000 1) 和关节肿胀数(r=0.37；P=0.01) 相关。Ohata等[58]研究结果显示，类风湿性成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS) 可产生BAFF，尤其是在IFN-γ和TNF-α的诱导下，FLS表达BAFF mRNA和蛋白质的水平明显提高。此外，中性粒细胞常大量存在于RA患者的关节滑液中，可能是滑膜间隙BAFF水平升高的来源；巨噬细胞是RA形成期滑膜腔BAFF的来源。因此预测BAFF是由关节腔产生，促进B细胞增殖、存活和分泌，从而加速关节炎症的恶化[59]。

以BAFF为靶点，用于治疗自身免疫性疾病的3个主要拮抗剂如表 1所示。本文简单介绍这3个候选药物的特征及其临床试验的初步结果。

Belimumab是一种全人源重组的单克隆IgG1-λ抗体，旨在特异性靶向BAFF，阻止BAFF与其受体的相互作用，从而减少外周幼稚期、过渡期和活化期B细胞的数量[60]。迄今为止，单克隆抗体Belimumab是美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局批准的唯一治疗SLE的生物药物。2020年12月，美国食品药品监督管理局还批准Belimumab用于治疗活动性狼疮性肾炎[61]。

Belimumab的应用促进了近半数的SLE患者病情明显好转，表现为抗dsDNA滴度降低、皮质类固醇减少、皮肤反应减少、耀斑减少等。而其不良反应包括呼吸、消化道和泌尿道感染等，与BAFF缺乏缺陷相似[31]。针对SLE，Belimumab临床Ⅲ期试验的主要指标为SRI-4 (SLE responder index-4)，次要指标包括医师的整体评估的平均变化、健康相关生活质量测量、首次出现严重SLE耀斑指数的时间、不良事件等。SRI-4的定义为SLE激素安全国家标准的SLE疾病活动指数(safety of estrogens inlupus erythematosus national assessment-systemic lupus erythematosus disease activityindex, SELENA-SLEDAI) 得分实现至少4点改善、在医生全球评估疾病活动度增加少于10%、在不列颠群岛红斑狼疮活动组(british isles lupus activity group, BILAG) 疾病活动度指数方面无中度/重度器官疾病恶化[62]。在Ⅲ期试验(NCT00424476、NCT00410384和NCT01484496) 中，与安慰剂组相比，Belimumab单抗在静脉和皮下给药的SLE患者中显示出更高的疗效，达到SRI-4反应标准[63]。Ⅲ期试验结果分析表明，Belimumab对高疾病活性、异常血清学(低补体血症和/或高的抗dsDNA滴度) 或接受糖皮质激素治疗的患者更为有效[64]，Belimumab可以减少皮质类固醇激素的使用量[65]。但是在对黑人种族SLE患者的Ⅳ期临床试验(NCT01632241) 中，则没有达到SRI-4的主要终点[65]。

在针对SS的Ⅱ期试验(NCT01008982、NCT01160666) 中，观察到使用Belimumab后，SS患者血管干燥、EULAR-干燥综合征患者报告指数和EULAR-干燥综合征疾病活动指数改善，并且在第52周有持续改善的趋势，但是唾液腺功能没有改善，只是减少了非恶性涎腺肿胀[66]。而且，60%的SS患者在Belimumab治疗6个月至1年间没有任何新的副作用，显示出该药良好的安全性。

Belimumab可通过选择性地消耗B2细胞或通过间接减少其他促炎症细胞因子来发挥作用。除降低疾病活动性外，Belimumab还可以通过中和BAFF与其血管生成细胞受体的结合介导内皮损伤与修复的失衡进而限制SLE相关动脉粥样硬化过程的进展[67]。它通过与可溶性或非膜结合的人源BAFF结合抑制B细胞增殖，但其与三聚体、异三聚体和60聚体结合的特异性尚不清楚[2]。但是，Belimumab不能抑制BAFF的60聚体，且不能通过消耗表达膜BAFF的细胞来发挥作用[68]。Belimumab单抗的特异性仅限于三聚体BAFF。Shin等[9]研究推测Belimumab与膜结合BAFF的接近可能受到膜结合BAFF三聚体相互作用增强的阻碍(图 5)，因为Belimumab的结合需要破坏三聚体相互作用，所以Belimumab不作用于膜结合BAFF。

Tabalumab是一种人IgG4-κ抗BAFF单克隆抗体，可靶向膜结合BAFF和可溶性BAFF[60]，由美国礼来公司开发。Tabalumab可以抑制60聚体BAFF[60]。Tabalumab已经在Ⅲ期临床(NCT02041091，NCT01488708) 的研究中进行了测试，其效果与Belimumab相似，SLE患者体内的补体活性增加，抗dsDNA-IgG滴度和B细胞数量减少，促使大约35%接受高剂量Tabalumab治疗的患者的临床症状轻微改善[30]。

由于未能在用于RA (FLEX-O、FLEX-V和FLEX-M) 的Ⅲ期临床的所有试验中证明其降低类风湿关节炎活动性的有效性，因此FLEX-V和FLEX-M试验提前终止。在RA项目失败后，礼来公司选择继续进行SLE和多发性骨髓瘤的研究。在SLE的Ⅲ期临床试验中，在两周和每月皮下注射120 mg药物方案中(NCT01196091)，Tabalumab再次未能达到主要疗效终点[69]。基于这些结果，礼来公司于2014年宣布终止整个Tabalumab开发计划[69]。

Atacicept是一种全人源重组融合蛋白，包含与人IgG1 Fc区相连的TACI受体的胞外区。Atacicept结合BAFF和APRIL并抑制TACI介导的信号传导的激活[60]。Atacicept中和了BAFF和APRIL三聚体及其所有异聚构型[20]。体外和临床前动物模型研究中，Atacicept对BAFF和APRIL的双重抑制作用比单独抑制BAFF更有效，从而导致自身反应性B细胞、浆细胞和Ig水平降低[70]。

两项Ⅱ期研究(NCT00595413、NCT00430495) 表明，Atacicept对甲氨蝶呤或TNF拮抗剂反应不足的RA患者无效，与安慰剂组相比，服用Atacicept组的患者发生不良事件的频率略高。然而，Atacicept显示出显著的生物活性，可以降低患者体内Ig和类风湿因子水平[71]。但迄今为止，关于Atacicept的Ⅱ期研究未能达到RA患者的主要疗效终点。

针对SLE的研究(NCT01972568) 显示，在第24周时，每周皮下注射150 mg Atacicept的患者与注射安慰剂组患者相比，疾病活动度明显降低。Atacicept对这些潜在的靶向治疗终点有显著的治疗效果，支持了这种治疗的继续[72]。另一项研究(NCT02070978) 中，接受Atacicept治疗的高疾病活动性患者中，有更大比例的患者表现出低SLE应答指数，并且与安慰剂治疗的患者相比，严重耀斑的风险降低[70]。与安慰剂相比，Atacicept治疗的紧急不良事件(treatment-emergent adverse event, EAE) 发生率通常更高。然而Gordon等[70]认为Atacicept剂量和心律不齐、严重感染、前庭疾病、抑郁症或恶性肿瘤和未指明的肿瘤没有相关性。在Ⅱ/Ⅲ期试验(NCT00624338) 的事后分析中，与安慰剂相比，经皮下注射150 mg Atacicept可以预防SLE发作并延缓首次发作的时间[73]；注射75 mg Atacicept组则未达到减少新发作的SLE患者人数的主要治疗终点[74]。高剂量(150 mg) 的结果显示较好的治疗效果，但由于该组有两人死亡(461名参加者)，因此不排除存在感染风险的担忧。总之，Atacicept在中度至重度SLE患者中显示出有益的作用，并具有可接受耐受性。虽然Atacicept剂量与特定TEAE或死亡率之间尚未发现一致的关联，但安全性值得进一步评估。

由上可见，BAFF通路是一个很有前途的自身免疫病阻断靶点。然而，目前对BAFF异聚体和60聚体以及自身免疫疾病的发病机制研究还不够透彻，通过对其深入了解有助于促进更有效治疗方案的开发。传统的免疫抑制药物在很大程度上是非特异性的，并且常常针对不同的淋巴细胞亚群，偶尔会产生安全问题，存在严重缺陷。Belimumab在系统性红斑狼疮中的应用是开发针对BAFF系统抗体药物的重要一步，但是其仅阻断可溶性BAFF三聚体。目前，还有多种抗体，如VAY-736 (一种针对BAFF-R的人源化去岩藻糖基化工程化抗体)、Blisibimod (也称为A-623或AMG 623，是一种肽体，可与BAFF的可溶性和细胞膜结合形式结合) 正在开发中，显示出广阔的应用前景，需要进一步研究，以更好地了解这些药物的长期安全性和疗效。

候选药物临床开发耗时长，为了提高药物研发的成功率，有以下几个方案：1) 应考虑单个或联合对BAFF受体的靶向性治疗，而不仅仅对BAFF本身；2) 来源于骆驼科、海洋软骨鱼的纳米抗体结构简单，易与受体结合，而且具有易表达、免疫原性小、可溶性好、稳定性强等优点，可以用于研发针对BAFF的抗体药物；3) 通过筛选多种亲和力高的抗体联合对BAFF靶点进行结合来阻断疾病的发展。