细胞系的传代数效应

连续细胞系在体外几乎无限期存在的能力开启了可疑的继代培养实践的可能性，因此也开启了可疑的科学数据。细胞系经历的传代程度通常表示为“传代数”，通常可以认为是细胞从容器转移到容器的次数。越来越多的文献表明，随着时间的推移，传代次数会影响细胞系的特征。1-6与低传代细胞相比，高传代细胞系在形态、对刺激的反应、生长速率、蛋白质表达和转染效率方面发生变化。

科学界注意到细胞系质量对于成功的实验至关重要，避免使用培养时间过长的细胞系是确保可靠和可重复结果的重要一步。但是，尽管传代数相关对细胞系的影响的证据令人信服，但人们对传代依赖性变化的潜在机制以及研究人员在实验中可以采取的避免传代数影响的行动知之甚少。

通过效果的令人信服的数据检查对哺乳动物细胞系的传代依赖性影响的研究多种多样，重点关注广泛的细胞类型和功能，例如致瘤性、分化、基因表达和细胞信号传导。传代次数也会影响昆虫细胞系，显着降低蛋白质产量和细胞生产力。以下来自同行评审文献的示例集中在低传代细胞系和高传代细胞系之间的差异。

稳定转化的小鼠胰岛素瘤细胞

O'Driscoll 的一项研究比较了低传代（第 18 代）和高传代（第 40 代）的 MIN-6 细胞，发现参与调节分泌、粘附和增殖的许多 mRNA 的表达存在显着差异。10发现近 1,000 个基因在低传代细胞和高传代细胞之间存在差异表达，他们的研究还表明传代数在这种细胞类型的分化状态中起作用。

人前列腺细胞，在 Lin 的另一项研究中，在低传代（第 25 代）和高传代（第 60 代）检查了常见的前列腺癌细胞系 LNCaP。此处的分析表明，PI3K/Akt 通路以通道数依赖性方式调节雄激素受体活性，这可能对前列腺癌的各个阶段都有影响。

从培养中的细胞处于环境和操纵压力下的概念开始，“为什么”和“如何”发生的基因型和表型变化变得更加明显，包括构成传代效应的机制。培养中的细胞不断受到竞争和自然选择的进化过程的影响。

大多数细胞培养物代表了竞争资源（如生长因子、盐和核酸）的异质群体。当获得优势时，例如更快的生长速度，一种细胞类型可能会在单个群体中过度生长另一种细胞类型。这种竞争产生了不再正确代表原始起始材料的现存种群。随着传代次数的增加，去分化和组织特异性功能丧失等事件应被视为常态。

转化的和患病的细胞系是特别值得关注的，因为它们代表异常的起始种群，其中随着时间的推移在基因型和表型水平上迅速发生进化变化。在这些细胞类型中，一种或所有典型的细胞检查点基因，如 p16/INK4a、pRB 和 p53，已经被改变，从而使细胞变得“永生”。这些改变通常与其他细胞突变同时发生，并且这些细胞系的持续继代培养加剧了基因组的不稳定性。

多少段太多了？

不存在确定细胞系传代数的直接方法。对细胞系中传代相关影响的文献回顾表明，影响是复杂的，并且在很大程度上取决于许多因素，例如细胞系的类型、组织和来源物种、培养条件和应用细胞被使用。例如，ATCC 未发表的数据显示高通道 Caco-2 细胞在转染后表现出 GFP 报告基因的表达增加，而高通道 MCF7 细胞系表现出 GFP 水平下降。

更复杂的问题是，一个细胞系的传代水平被认为“高”可能不会在另一个细胞系中产生任何显着的传代效应。防止传代相关效应影响实验变成了确定传代数范围的问题，在该范围内可以对给定的细胞系进行一致的一组实验。

最小化细胞系传代效应的基本第一步

研究人员可以使用各种武器来帮助避免通道依赖性效应并确保有效且可重复的实验结果。从高质量细胞开始是必不可少的第一步，因为来自知名生物资源中心 (BRC) 的细胞可能具有良好的特征、更广泛的测试和来自较低通道的细胞。例如，ATCC 遵循严格的种子库细胞库方法，以确保分布一致的低传代细胞培养物。

优化细胞环境也是关键——仔细选择培养基和血清，用缓冲液和气体控制 pH 值，监测温度并注意生长表面。13根据生长曲线数据收集、喂养和储存细胞，练习良好的细胞培养技术。最后，对本地或从 BRC 以外的来源获得的细胞系进行鉴定和表征测试。

评估和最小化通道数水平

使用细胞系时，进行基本测试以指定可接受的传代数范围以保持一致的细胞性能是良好的细胞培养实践。

研究人员应建立基线和参考点，用于检查实验或应用中不可接受的差异。常规细胞系监测包括细胞形态检查、识别感兴趣基因的标记和将表达与传代数相关联，以及建立实验标准，如生长速率或蛋白质表达水平。

观察细胞形态是识别细胞健康和稳定性的最简单、最直接的方法。从高密度和低密度培养物的比较观察中获得形态信息取决于对几个因素的了解。根据细胞的健康状况，以及在某些情况下，分化状态，细胞系之间的形态可能会有所不同。形态可以随着电镀密度以及不同的培养基和血清组合而改变。细胞形态最好通过频繁、简短的观察来监测。一般来说，如果一种文化有不寻常的外观，则可能存在问题。建议研究人员在定期形态检查期间保持警惕，并维护细胞形态图像以进行比较。

从生长曲线数据评估细胞增殖率可以产生有关培养物对刺激反应的有价值的信息。突然减少或增加表明人口中可能发生了变化。执行生长曲线分析是监测培养物一致性和确定许多其他关键特征的关键要素，例如继代培养的最佳时间、最佳稀释度和不同细胞密度下的估计接种效率。生长曲线分析还可以帮助确定种群倍增时间，当酶或功能分析迫在眉睫时应常规进行。通常应使用具有一致生长特性的细胞系。