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测定RNA浓度和纯度,这些要点要知道
点击次数: 更新时间:2017/10/19 10:01:51
实验原理 一般来说OD260代表核酸的吸光度,OD280代表蛋白质的吸光度。OD230代表其他杂质(多糖等)的吸光度。一般认为,OD260/OD280的比值在1.8至2.0之间认为RNA居多且较纯。当比值低于1.8时,考虑有蛋白质或酚污染;当比值高于2.0时,表明可能有异硫氰酸残存。 (实拍图) 具体操作 1、UV-1600PC紫外分光光度计开机预热20min; 2.设定紫外波长 260nm,用ddH2O洗涤比色皿,向比色皿中加入 50ul ddH2O,放入样品室的S池架上,校零; 3.将待测样品稀释(RNA 5ul用ddH2O稀释至50μl)混匀后,记录编号和稀释倍数; 4.把混匀的待测样品移入干净的比色皿中,放进样品室的S架上,记录稳定的OD260(A260)的值; 5.以同样的方式测待测样品在280nm下的OD值; 6.计算待测样品的浓度与纯度: RNA样品的浓度(ng/μl)=OD260×稀释倍数×40; 纯度=OD260/OD280 举例说明 某客户某一组样品RNA测得OD260=1.016Abs,OD280=0.533Abs 根据计算公式可得:
RNA浓度 1.016×40×10=406.4 ng/ul
RNA纯度 1.016/0.533=1.906
此浓度和纯度均适合做PCR。 问题分析
(1)蛋白质污染:确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量,确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低,则用氯仿重新抽提一次,再沉淀,溶解。 (2)苯酚残留:确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。 (3)多糖或多酚的残留:一些特殊的组织和植物中,多糖、多酚含量较多,这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此,从这类材料中提取RNA时,需要注意多糖、多酚杂质的去除。 (4)设备限制:测定OD260及OD280数值时,要使OD260读数在0.1-0.5之间,此范围线性最好。用水稀释样品:测OD值时,对照及样品稀释液请使用10 mM Tris,pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。 上一篇: 组织RNA提取常见问题集锦,给有需要的你! 下一篇: 细胞中mRNA原位杂交技术1 |
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