Western Blotting 转印技术

实现蛋白从凝胶到膜的高效转移

在蛋白免疫印迹实验中，转印是电泳之后的步骤。该步骤将蛋白从凝胶基质移动到合成膜支持物上，并与膜相结合，形成印迹。

可选择传统湿转、半干转或最新的快速半干转 方法。

准备足够的转印缓冲液，用于转印槽以及凝胶、膜的预平衡。

请注意，快速半干转系统使用专门的缓冲液，且不需要预平衡凝胶。

如有必要，用 转印缓冲液预先平衡凝胶和印迹膜。

将凝胶和膜放置在被缓冲液浸湿的滤纸之间，做成转印“三明治”。

将“三明治”放入转印槽，并加入转印缓冲液，选择合适的转印条件，开始转印过程。

电转印过程中的凝胶和膜放置

电转印是蛋白免疫印迹中最常见的转印方法，即使用电场力驱动蛋白从凝胶中洗脱转移到膜上。此过程中，膜和凝胶放置在一起，并在两个电极之间放置滤纸。在电极之间施加电压，蛋白在电场力的作用下迁移到膜上。

电极之间产生的电场强度（以V / cm为单位测量）是实现转印的驱动力。电压及电极间距都会影响蛋白从凝胶中洗脱的速率。针对不同分子量的蛋白需要进行转印条件优化，以防止转印不足（蛋白不完全从凝胶中转移到膜上），或转印过度（蛋白穿透印迹膜造成损失）。

转印设备和过程主要有三种： 湿转系统，半干转系统和快速转印系统。

湿转系统适用于大多数各种分子量的常规蛋白转印。转印过程中凝胶和膜被浸入充满转印缓冲液的槽中。

凝胶和膜被夹在预先润湿缓冲液的滤纸之间，滤纸与平板电极直接接触。半干转系统的安装使用比湿转简单。

快速转印系统是最近发展出来的技术，使用专用设备、专用滤纸及专用缓冲液来快速有效地转印蛋白。通常滤纸和湿润的膜预先放在一次性包装中，简化了转印“三明治”的组装。

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转印缓冲液包含强导电性化学缓冲试剂（例如Tris，CAPS或碳酸盐），以便在转印过程中保持系统的电导率和pH值。另外，转印缓冲液中也有可能含醇（甲醇或乙醇）以促进蛋白与膜的结合，同时也可以添加SDS促进蛋白从凝胶中洗脱。

SDS和醇在转移中起相反的作用。 SDS可以促进蛋白质从凝胶中洗脱，如果某些蛋白质难以从凝胶中洗脱，则可以将SDS添加到转印缓冲液中。但是，转印缓冲液中的SDS会降低蛋白质与硝酸纤维素膜的结合效率；如果需要，可以使用PVDF膜作为替代。

醇可从SDS-蛋白质复合物中除去SDS，并改善蛋白质与硝酸纤维素膜的结合。但是醇会导致凝胶孔径减小，影响蛋白迁移；还会导致某些蛋白或碱性蛋白沉淀，还会使碱性蛋白带正电荷或处于中性状态。

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硝酸纤维素膜很容易在水或转印缓冲液中润湿，并且与多种蛋白检测方法兼容。无支持的硝化纤维素很脆，不建议用于抗体剥离及重孵育实验。

增强型硝酸纤维素膜是含有惰性支撑结构的硝酸纤维素膜。这种额外的支撑使膜具有更高的强度和弹性，可以用于抗体剥离及重孵育，并可承受高压灭菌（121℃），依然保持硝酸纤维素的易润湿性。

PVDF 膜具有很强的蛋白结合能力（约为硝化纤维素的两倍），并且在通常的处理中不易破裂，因此可以用于抗体的剥离和重孵育实验。

低荧光背景的 PVDF 膜结合了 PVDF 的优势，并且在很宽的波长范围内具有低自发荧光。在长时间曝光情况下，不会增加背景荧光水平，有利于检测微弱的荧光信号。

膜通常有两种孔径可供选择：

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