干货

图2 DSB 产生后的非同源修复和同源修复

以上是CRISPR/Cas9简介，接下来将系统性介绍如何运用该技术进行基因编辑。以Cas9-sgRNA 共表达质PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0)为例，图3为利用CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中进行基因编辑的主要流程图。

图3 利用CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中进行基因编辑的主要流程图

sgRNA设计及表达载体构建

sgRNA 设计在线工具:

1．http://crispr.mit.edu/

2.http://www.broadinstitute.org/mpg/crispr_design/

3．http://spot.colorado.edu/~slin/cas9.html

4．http://www.e-crisp.org/E-CRISP/

5．http://flycrispr.molbio.wisc.edu/

6.http://www.flyrnai.org/crispr/Drosophila/

7.http://cas9.cbi.pku.edu.cn/index.jsp

8.http://eendb.zfgenetics.org/casot/index.php

9.http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx

10.http://cas9.wicp.net/

11.http://cropbioengineering.iastate.edu/cgat

12.http://crispor.tefor.net/

sgRNA设计

根据编辑位点，将该位点附近序列片段输入在线设计软件的input对话框中，选择位置合适以及脱靶效率较低的sgRNA。根据所选择的内切酶，在sgRNA(表达sgRNA的模板DNA)两端加上粘性末端接头。

5‘-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3‘- CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-CAAA-5’

例：以质粒PX459 (pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0)为例，Bbs1 酶切

1) 基因水平敲除: sgRNA尽量选择在启动子、功能比较重要或者序列比较保守的外显子上

2) 敲入: 特别是单碱基编辑，Cas9蛋白切割位点位于sgRNA第17与第18碱基之间即靠近3’端PAM序列, 选择的sgRNA使插入位点靠近Cas9蛋白切割位点。

以最后一款sgRNA设计工具crispor （http://crispor.tefor.net/）为例

Step1. 根据实验目的，将从数据库（NCBI 或Ensemble或 UCSC）得到的序列输入以下对话框，该在线设计工具crispor能输入的序列较长（