一代测序中的双峰杂合子峰图及计算方法

虽然二代测序应用越来越多，但是有些实验还是需要用到一代。记录下双峰这个常见的问题。

需要注意的是，上面这种重峰是不能通过人为的计算来解决的，只能通过克隆，或者重新扩增测序来解决。具体原因可能有：DNA模版污染、引物不够专一、扩增温度过低、Ploy结构等等。

上面杂合子双峰图中，从红色箭头开始往后面的所有数据在不经过处理的情况下是不可信的。形成这种双峰的原因就是杂合子在这个片段的碱基缺失造成的。如果这个片段是外显子区域，那这个缺失可能是3或者3的倍数（氨基酸密码子3）。若处于内含子片段，那可能缺失1个或者多个碱基。

像这种双峰图可以通过计算来解决。当然也可以通过克隆等方式来解决。

如果双峰的长度不长，通过计算来解决是一个非常有效，省时省力省经费的方式。

计算方式：

1.首先根据峰图把后面的序列按下面格式写出来。看峰图，写碱基。红色T，绿色A等等。注意图中红色圈出的位置，因为根据前后的峰图可知，这个地方应该也是两个碱基，只不过刚好碱基一样，峰图也就不是双峰了。

2.检查写出的序列，查看是缺失几个碱基。如图，每相邻的两个碱基，都能找到一个一样的碱基，说明在红色箭头处杂合子的某个序列缺失了一个碱基。如果是缺少两个碱基，则每隔一个碱基就能找一个一样的碱基。

3.圈出序列。例如我要圈第二列的碱基，就是圈出第一列的相同的碱基。注意：后面GC碱基那里，如果都相同，就需要根据峰图或者后面的序列来推出要圈出的碱基。比如我这里总和峰图和后面的碱基，这个地方都是GCCCG才合理，所以我圈的是G ，下一列圈的是C。

之后将圈出的所有碱基写成一行，另一个写成一行。这样就得出杂合子的两条序列了。

这里可以看出，蓝色序列在第一列缺失了一个碱基。后面又在第三列和第四列发生碱基突变。

至于解出来之后用哪一条序列，需要根据实际情况来分析。。。