慢病毒介导过表达hTERT人口腔黏膜上皮稳定细胞系的构建

阅读量：

229

作者：

曾飒

展开

摘要：

目的:口腔黏膜疾病是发生于口腔黏膜的所有疾病的总称,其种类繁多,病因复杂且多数疾病的致病机理尚未完全明确.其中起源于口腔黏膜的恶性肿瘤不仅发病率高而且成为影响人们生活质量的常见疾病,甚至严重威胁着生命健康.由于正常的OMECs体外培养困难,对细胞营养要求高而且存活时间短,一般传代培养5~6代后即开始衰老死亡,这严重限制了我们对其发病机制的深入研究,因此,迫切需要一个能够长期稳定传代的OMECs系来作为体外细胞实验模型.本文研究目的:1.使用慢病毒过表达系统构建pLVX-puro-hTERT重组质粒并对其进行包装;2.以包装成功的慢病毒颗粒感染口腔黏膜上皮细胞(OMECs),建立稳定表达外源性人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的口腔黏膜上皮细胞系,为探索建立高效,稳定的永生化口腔上皮细胞系提供新的思路.方法:1.通过提取293T细胞总RNA,RT-PCR方法扩增获得hTERT基因全长,构建重组慢病毒载体p LVX-puro-hTERT并使用辅助包装系统将其包装为慢病毒颗粒;2.通过使用DisepaeⅡ酶分离,结合Human Epidermal Keratinocyte Complete Medium Kit无血清培养基培养,体外分离培养获取原代OMECs,并用包装好的慢病毒颗粒感染OMECs,通过嘌呤霉素抗性筛选得到阳性克隆,进行传代培养,倒置相差显微镜下观察其生物学性状;3.采用qRT-PCR和Western blot检测培养7代后感染细胞中hTERT基因的mRNA及蛋白表达水平.结果:1.通过RT-PCR获得目的基因片段hTERT,核酸电泳检测可见3kb处有一条亮带,与目的基因大小基本一致.2.重组质粒pLVX-puro-hTERT经NheI和EcoRI双酶切鉴定后,可在3.3kb左右处得到一条亮带,初步表明hTERT已成功插入慢病毒载体pLVX-puro.3.通过对重组质粒进行DNA测序,进一步证实重组慢病毒载体pLVX-puro-hTERT构建成功.4.显微镜下观察可见成功转染hTERT的OMECs与正常OMECs形态相似,细胞呈多边形,"铺路石"状紧密排列,具有典型的上皮细胞特征.而转染空载体后的细胞形态较不规则,未转染细胞和转染空载体后的细胞传4-5代后生长缓慢,逐渐衰老死亡,而转染hTERT后的OMECs仍生长迅速并且增殖稳定.5.qRT-PCR检测转染后OMECs中hTERT的相对表达,结果显示:hTERTmRNA在转染细胞中高表达,与正常OMECs组中hTERTmRNA的表达量呈显著性差异.表明慢病毒介导的hTERT基因片段已稳定整合到OMECs的基因组中并高表达(P0.01).6.Western blot结果显示在转染细胞组中hTERT蛋白成功表达,与正常细胞组呈显著差异.这说明hTERT基因已成功整合入口腔黏膜上皮细胞的基因组并可进行翻译.结论:本研究通过慢病毒法成功建立了过表达hTERT的OMECs稳定细胞系,初步证明了使用慢病毒载体介导hTERT基因永生化OMECs的可能性及优越性,为探索构建高效,稳定增殖的人永生化口腔粘膜上皮细胞细胞系提供了新思路.

展开

关键词：

OMECs hTERT 慢病毒载体 稳定表达 永生化

学位级别：

硕士

学位年度：

2016

DOI：

10.7666/d.D01034114