SABC

使用说明： 1. 参考表1配制SABC工作液 表1. SABC工作液配制表

注1：为确保充分形成Streptavidin-Biotin Complex，刚配制后必须室温至少放置30min后才能使用。 注2：配制好的SABC工作液必须在24h内使用完毕。 注3：SABC稀释液：PBS, pH 7.4, 0.05% Tween-20 (除ELISA检测外，推荐使用碧云天的P0267 QuickBlock™免疫组化染色二抗稀释液或P0110免疫染色(非荧光)二抗稀释液；ELISA检测推荐使用P0110免疫染色(非荧光)二抗稀释液)。通常宜选择有一定封闭能力的SABC稀释液，这样检测结果的背景通常会更低。 2. 免疫组化染色(IHC) a. 需用户自行准备的试剂 (a)洗涤液(推荐使用碧云天的P0106/P0106C/P0106L免疫染色洗涤液)。 (b)固定液：4%多聚甲醛(推荐使用碧云天的P0098免疫染色固定液)。 (c)封闭液(推荐使用碧云天的P0260 QuickBlock™免疫染色封闭液或P0102免疫染色封闭液)。 (d)一抗。 (e)一抗稀释液(推荐使用碧云天的P0262 QuickBlock™免疫染色一抗稀释液或P0103免疫染色一抗稀释液)。 (f)二抗(推荐根据样品的种属特异性选购碧云天的A0279/A0288生物素高效标记二抗，其推荐的稀释比例均为1:100)。 (g)二抗稀释液(推荐使用碧云天的P0267 QuickBlock™免疫组化染色二抗稀释液或P0110免疫染色(非荧光)二抗稀释液)。 (h)DAB显色液(推荐使用碧云天的P0202/P0203 DAB显色试剂盒)。 b. 染色方法 (a)按照常规方法制备石蜡或冰冻切片并灭活内源性过氧化物酶(推荐使用碧云天的P0100A内源性过氧化物酶封闭液或P0100B内源性过氧化物酶强力封闭液)。 (b)抗原的修复：根据不同的抗原和切片的种类，选择把切片放置在适当的抗原修复液中进行抗原修复(推荐使用碧云天的P0081/P0083/P0085/P0086/P0088/P0090/P0092相关抗原修复液)。 (c)洗涤液洗涤组织切片5min×4次。 (d)滴加封闭液封闭组织切片10-60min。使用P0260 QuickBlock™免疫染色封闭液仅需封闭10min，普通封闭液封闭60min。 (e)滴加一抗工作液，室温缓慢摇动孵育1h或静止孵育1-2h (为改善染色效果，可以4℃孵育过夜)。 (f)洗涤液洗涤组织切片5min×4次。 (g)滴加生物素标记二抗工作液，室温缓慢摇动孵育30-60min或静止孵育1-2h。孵育期间，参考表1配制SABC工作液，配制后应室温至少放置30min后才可以使用。 (h)用洗涤液洗涤组织切片5min×4次。 (i)滴加100μl的SABC工作液，室温缓慢摇动孵育30min或静止孵育1h。 (j)洗涤液洗涤组织切片5min×4次。 (k)滴加约100μl DAB显色工作液，确保能充分覆盖样品。室温(约25℃)避光孵育约3-15min，至显色达到预期效果即可去除DAB显色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次以终止显色反应。 3. 免疫细胞化学染色(ICC) a. 需用户自行准备的试剂 (a)洗涤液(推荐使用碧云天的P0106/P0106C/P0106L免疫染色洗涤液)。 (b)固定液：4%多聚甲醛(推荐使用碧云天的P0098免疫染色固定液)。 (c)封闭液(推荐使用碧云天的P0260 QuickBlock™免疫染色封闭液或P0102免疫染色封闭液)。 (d)一抗。 (e)一抗稀释液(推荐使用碧云天的P0262 QuickBlock™免疫染色一抗稀释液或P0103免疫染色一抗稀释液)。 (f)二抗(推荐根据样品的种属特异性选购碧云天的A0279/A0288生物素高效标记二抗，其推荐的稀释比例均为1:100)。 (g)二抗稀释液(推荐使用碧云天的P0267 QuickBlock™免疫组化染色二抗稀释液或P0110免疫染色(非荧光)二抗稀释液)。 (h)DAB显色液(推荐使用碧云天的P0202/P0203 DAB显色试剂盒)。 b. 染色方法(以6孔板为例) (a)细胞固定：去除培养液，用PBS洗涤细胞1次。每孔加入1ml固定液。固定10min后去除固定液，用洗涤液洗涤3次。 (b)细胞打孔：如果上一步的洗涤使用的是碧云天的P0106 免疫染色洗涤液等或其它含有0.1% Triton X-100的洗涤液可以忽略本步骤。否则每孔加入1ml含0.1%的Triton X-100的适当洗涤液，室温静置5min后去除洗涤液。 (c)内源性过氧化物酶的灭活：按常规方法灭活内源性过氧化物酶(推荐使用碧云天的P0100A内源性过氧化物酶封闭液或P0100B内源性过氧化物酶强力封闭液)。 (d)加入1ml封闭液，室温封闭10-60min。使用P0260 QuickBlock™免疫染色封闭液仅需封闭10min，普通封闭液封闭60min。 (e)去除封闭液，每孔加入0.5-1ml一抗工作液，室温缓慢摇动孵育1h或静止孵育1-2h (为改善染色效果，可以4℃孵育过夜)。 (f)每孔加入1ml洗涤液，室温缓慢摇动或静止放置洗涤5min×4次。 (g)吸尽洗涤液，每孔加入0.5-1ml生物素标记二抗工作液，室温缓慢摇动孵育30-60min或静止孵育1-2h。孵育期间，参考表1配制SABC工作液，配制后应室温至少放置30min后才可以使用。 (h)每孔加入1ml洗涤液，室温缓慢摇动或室温静止放置洗涤5min×4次。 (i)每孔加入500μl SABC工作液，室温孵育30min。 (j)每孔加入1ml洗涤液，室温缓慢摇动或室温静止放置洗涤5min×4次。 (k)每孔加入500μl DAB工作液，室温(约25℃)避光孵育约3-15min，至显色达到预期效果即可去除DAB显色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次以终止显色反应。显色期间，可以在显微镜下观察显色情况，以确定继续显色还是终止显色反应。

图2. Hela细胞Tubulin免疫染色效果图。A. 阴性对照组(不加一抗)。B. SABC-HRP实验组。C. HRP标记二抗对照组。

4. Western Blot a. 需用户自行准备的试剂 (a)封闭液(推荐使用碧云天的P0252 QuickBlock™ Western封闭液或P0023B Western封闭液)。 (b)洗涤液(推荐使用碧云天的P0023C/P0023C3/P0023C6 Western洗涤液)。 (c)一抗。 (d)一抗稀释液(推荐使用碧云天的P0256 QuickBlock™ Western一抗稀释液或P0023A Western一抗稀释液)。 (e)二抗(推荐根据样品的种属特异性选购碧云天的A0279/A0288生物素高效标记二抗，其推荐的稀释比例均为1:100)。 (f)二抗稀释液(推荐使用碧云天的P0258 QuickBlock™ Western二抗稀释液或P0023D Western二抗稀释液)。 (g)DAB显色液(推荐使用碧云天的P0202/P0203 DAB显色试剂盒)。 b. 检测方法 (a)SDS-PAGE电泳、转膜后，用封闭液室温缓慢摇动封闭10-60min。使用P0252 QuickBlock™ Western封闭液仅需封闭10min，普通封闭液封闭60min。 (b)将膜置于一抗工作液中，室温缓慢摇动孵育1h (为提高检测敏感度，可以考虑4℃缓慢摇动孵育过夜)。 (c)洗涤液洗涤5min×4次。 (d)将膜置于生物素标记二抗工作液中，室温缓慢摇动孵育1h。孵育期间，参考表1配制SABC工作液，配制后应室温至少放置30min后才可以使用。 (e)洗涤液洗涤5min×4次。 (f)将膜置于SABC工作液中，室温缓慢摇动孵育30min。 (g)洗涤液洗涤5min×4次。 (h)如果进行DAB显色：将膜置于适量的DAB工作液中，一般室温避光孵育3-15min即可，去除DAB显色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应；将膜自然风干后避光保存。DAB显色的检测效果参考图3。 图3. SABC法DAB显色检测效果图。常规法采用HRP标记二抗，SABC法采用本试剂盒。样品为Hela细胞总蛋白，上样量如图中所示。一抗是AT819 Tubulin抗体，稀释比例为1:1000。注：SABC法可以达到普通ECL发光试剂的检测灵敏度。但除非条件所限，否则我们更推荐使用碧云天的P0018A BeyoECL Star (特超敏ECL化学发光试剂盒)和HRP标记二抗进行Western检测。使用BeyoECL Star检测时的灵敏度比本试剂盒方法还要高约10倍或更多。 5. ELISA a. 需用户准备的试剂 (a)包被缓冲液：0.2M碳酸氢盐缓冲液，pH 9.4。 (b)洗涤液：PBS, pH7.4, 0.05% Tween-20, 0.1% BSA (推荐使用碧云天的P0106/P0106C/P0106L免疫染色洗涤液)。 (c)封闭液：PBS, 1% BSA (推荐使用碧云天的P0260 QuickBlock™免疫染色封闭液或P0102免疫染色封闭液)。 (d)抗原溶液：溶于包被缓冲液。 (e)一抗。 (f)一抗稀释液(推荐使用碧云天的P0103免疫染色一抗稀释液)。 (g)二抗(推荐根据样品的种属特异性选购碧云天的A0279/A0288生物素高效标记二抗，其推荐的稀释比例均为1:100)。 (h)二抗稀释液(推荐使用碧云天的P0267 QuickBlock™免疫组化染色二抗稀释液或P0110免疫染色(非荧光)二抗稀释液)。 (i)酶反应底物(推荐使用碧云天的P0209 TMB显色液)。 b. 检测方法(以96孔板为例) (a)每孔中加入50-200μl的抗原溶液，室温孵育1h或4℃过夜。 (b)去除孔中液体并在吸水纸上拍干残余液体，每孔用200μl洗涤液洗涤3次，去除孔中的液体并在吸水纸上拍干。 (c)每孔加入200μl的封闭液室温孵育60min。 (d)去除孔中液体并在吸水纸上拍干残余液体，加入100μl的一抗工作液，室温孵育30min。 (e)每孔用200μl洗涤液洗涤3次，去除孔中的液体并在吸水纸上拍干残余液体。 (f)每孔加入100μl生物素标记二抗工作液，室温孵育30min (此时应配制SABC工作液，配制方法参考表1)。 (g)每孔用200μl洗涤液洗涤3次，然后加入200μl洗涤液孵育5min。 (h)去除孔中的液体并在吸水纸上拍干，每孔加入100μl SABC工作液，室温孵育30min。 (i)每孔用200μl洗涤液洗涤3次，然后加入200μl洗涤液孵育5min，去除孔中的液体并在吸水纸上拍干。 (j)每孔加入200μl酶反应底物(推荐使用碧云天的P0209 TMB显色液)，室温避光孵育3-30min或更长时间，直至显色至预期深浅，测定吸光度。可以根据实验需要考虑加入显色终止试剂，如使用TMB显色，每孔可加入50μl的2M H2SO4终止反应，加入硫酸后，溶液呈黄色，此时可以在450nm测定吸光度。

常见问题： 1.背景太深 a.考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选择碧云天推荐的封闭液进行封闭。 b.内源性蛋白结合的生物素，内源性凝集素以及离子间的相互作用都会使背景显色加深。针对内源性蛋白结合的生物素可采用生物素检测封闭液进行封闭(推荐使用碧云天的P0101生物素检测封闭试剂盒)；对于内源性凝集素可在SABC稀释液中加入0.2M的ɑ-甲基甘露糖进行封闭；而对于离子间的相互作用带来的干扰，可以通过把SABC试剂溶于含有0.5M NaCl的缓冲液中来消除。 c.对于免疫染色，需注意用适当方法灭活内源性过氧化物酶。例如尝试碧云天的P0100B内源性过氧化物酶强力封闭液。 d.考虑适当降低一抗或二抗浓度。另外，选择适当强度的洗涤液，或适当延长洗涤时间也会有所帮助。 2.没有信号或信号太弱 a.评估样品中待检测的蛋白的表达水平是否足够高，最好能选择高表达的样品作为阳性对照。 b.考虑适当提高一抗或二抗的浓度。 c.适当延长显色或发光时间，另外须确定抗原修复对于所使用的一抗是否是必需或有效的。

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