揭示新型单加氧酶逆转四环素类抗生素对tet(X3)/tet(X4)阳性细菌活性机理

选用雌性BLAB/c小鼠（6-8周），进行小鼠感染实验。亚急性毒性试验，在48小时内，每12小时口服一次白花丹素（每组体重0、5、25 mg/kg）。连续观察各组小鼠7天的行为，观察毒性迹象，如体重变化。7天后，对小鼠实施安乐死，收集并观察不同器官（肝脏、脾脏和肾脏）的病理变化。

研究结果

1、白花丹素通过体外抑制tet(X3)/tet(X4)活性来恢复四环素类药物的抗菌活性

如图1a-c所示，白花丹素以浓度依赖的方式明显抑制了tet(X3)/tet(X4)的催化活性。此外，白花丹素与替加环素或四环素联用对抗 E. coli DH5α+pAM401-tet(X3)（图1d-e）和E. coli DH5α+pAM401-tet(X3) (图1f,g)表现出协同效应，但不含tet(X3)/tet(X4)的E. coli DH5α+pAM401未观察到协同作用（图1h, i）。因此，白花丹素治疗通过靶向tet(X3)/tet(X4)，有效地恢复了四环素类药物对tet(X3)/tet(X4)细菌产生的敏感性。

图1 白花丹素恢复了四环素的抗菌活性

图2a-b表明，白花丹素以剂量依赖性方式显著增强了四环素和甲烯土霉素对K. pneumoniae K12016p47EC和E. coli J53 p47EC的抗菌效果。此外，白花丹素与非四环素类抗生素（庆大霉素、红霉素、克林霉素或多粘菌素E）联用对E. coli DH5α+pAM401-tet(X3)（图2c）和E. coli DH5α+pAM401-tet(X4)（图2d）存在协同效应或叠加效应，表明白花丹素是一种预期的广谱增效剂。

图2 四环素类和其他抗生素与白花丹素联用对tet(X3)/tet(X4)阳性菌株的抗菌活性

如图3a所示，浓度不超过64 μg/mL的白花丹素对E. coli DH5α+pAM401-tet(X4)的生长没有明显影响。与没有杀菌效果的单一疗法相比（图3b-c），白花丹素和四环素联用可在24小时内完全杀死所有受试细菌。如图3d-e所示，在接受单一处理或不接受处理的样本中，大多数细菌的细胞形态正常，而联合处理的细菌，细胞壁明显收缩，且增加了E. coli DH5α+pAM401-tet(X4)的细胞通透性和死亡率。

图3 白花丹素与四环素联用，通过破坏细菌的表面结构有效地杀死了细菌，但是不影响细菌生长

2、白花丹素与tet(X3)/tet(X4)相互作用机制的鉴定

生物层干涉术（BLI）表明白花丹素与tet(X3)/tet(X4)的亲和常数KD分别为2.0 × 10-4 M和1.6 × 10-3 M（图4a-b）。圆二色谱显示，白花丹素的处理诱导tet(X3)和tet(X4)二级结构发生了改变，如α-helix1、α-Helix2和翻转构象减少，抗-2构象增加（图4c-d）。说明白花丹素与tet(X3)/tet(X4)的结合，诱导tet(X3)/tet(X4)发生了二级结构改变。

图4 白花丹素与tet(X3)/tet(X4)蛋白的直接作用鉴定

采用分子对接和分子建模来探究白花丹素与tet(X3)/tet(X4)之间的结合模型。在平衡状态下模拟100 ns后（图5a-b），得到了tet(X3)/tet(X4)与白花丹素的3D结合模型（图5c-d）。白花丹素可以通过疏水作用结合到tet(X3)/tet(X4)的活性口袋。对于相互作用，范德华力的贡献更大，尤其是tet(X3)的PHE224和PHE319侧链和tet(X4)的LEU219和PHE221侧链（图5e-g）。如图5h-i所示，荧光光谱猝灭分析表明，所有突变体的结合常数（KA）均显著低于WT-tet(X3)/tet(X4)。浓度为32 μg/mL或是更低浓度四环素与白花丹素的组合中未观察到协同效应。对比携带WT-Tet(X)的细菌，携带突变体的细菌对四环素更敏感（图5j-k）。上述结果表明，白花丹素与tet(X3)/tet(X4)的活性口袋的直接结合诱导二级结构改变，进而抑制了tet(X3)/tet(X4)的催化活性。

图5 白花丹素与tet(X3)/tet(X4)结合模型的鉴定

3、白花丹素抑制了单加氧酶的表达

Tet(X3)/Tet(X4)，也称为单加氧酶。白花丹素处理后，tet(X3)和tet(X4)的DNA合成水平明显降低（图6a）。E. coli BL21+pGEX-4T-1-Tet(X3)/Tet(X4)诱导的tet(X3)/tet(X4)的产生受到白花丹素剂量依赖性抑制（图6b-c）。Western blot分析显示，在tet(X4) 阳性 E. coli J53 p47EC 中观察到由白花丹素介导抑制了tet(X4)的产生（图6d）。同时，白花丹素处理显著抑制了tet(X3)/tet(X4)的产生（图6e）。在四环素灭活单加氧酶tet(X3)和tet(X4)基因转录的RT-PCR分析中进一步检测到了减少趋势（图6f）。

图6 白花丹素抑制抗性基因tet(X3)/tet(X4)的转录和表达

4、白花丹素干扰细菌的氧化还原和代谢过程

采用代谢组学，研究白花丹素对携带tet(X3)/tet(X4)细菌的氧化还原和代谢过程是否存在干扰。图7a-c 展示的是主成分分析、单变量分析的火山图、差异代谢物的层次聚类分析和代谢途径分析，结果表明，经白花丹素处理后，E. coli DH5a+pAM401-tet(X3)/tet(X4)中出现了167种表达下调的代谢产物和88种表达上调的代谢产物。KEGG富集分析（图7d-e）进一步表明，差异表达基因（DEG）参与链霉素合成、精氨酸合成和细菌代谢相关途径，尤其是三羧酸（TCA）循环。此外，细胞内代谢物分析表明，经白花丹素处理后，TCA循环中柠檬酸盐、顺乌头酸盐和α-酮戊二酸盐的丰度显著增加（图7f）。

图7 经白花丹素处理的E. coli DH5a+pAM401-tet(X3)/tet(X4)的代谢组学分析

如图8a-b所示，经白花丹素（32 mg/mL）处理后，TCA循环速率的活性增强。白花丹素的加入显著提高了能量代谢途径中的ROS水平（图8c-d），并抑制细胞内ATP的生成（图8e-f）。总之，这些结果表明，白花丹素对tet(X3)/tet(X4)的抑制干扰了单加氧酶活性，并改变了细菌的代谢，同时增加了内膜通透性，这有利于白花丹素与上述抗生素的协同作用。

图8 白花丹素与四环素的协同作用机制

5、白花丹素与四环素联用可保护小鼠全身感染

通过对小鼠体内全身感染进行试验，进一步表明白花丹素与甲烯土霉素的协同作用。如图 9a-c所示，与未治疗小鼠和仅使用甲烯土霉素或白花丹素治疗的感染小鼠相比，联合治疗显著降低了肝脏、脾脏和肾脏中的细菌负荷。然而，白花丹素与甲烯土霉素的联用显著减少了肝脏中的炎症相关因子IL-6（图9d）、IFN-γ（图9e）及TNF-α（图9f）。

图9 在小鼠全身感染模型中，白花丹素和四环素类药物联用对tet(X4)-阳性E. coli 具有显著的协同作用

研究结论

1. 白花丹素和四环素类药物联用对携带Tet(X3)/Tet(X4)的细菌具有协同作用。

2. 白花丹素和Tet(X3)/Tet(X4)的互作机制表明，白花丹素可以直接与Tet(X3)/Tet(X4)的催化袋结合，诱导其二级结构发生改变，从而抑制单加氧酶的活性。

3. 仅使用白花丹素治疗或其与四环素类抗生素联用治疗增加了细菌的氧化应激及代谢。

4. 在携带Tet(X4)阳性 E. coli 的小鼠全身感染模型中，白花丹素的和甲烯土霉素联用表现出显著的疗效。

参考文献

[1] Xu L, Zhou Y, Niu S, et al. A novel inhibitor of monooxygenase reversed the activity of tetracyclines against tet (X3)/tet (X4)-positive bacteria[J]. EBioMedicine, 2022, 78: 103943.返回搜狐，查看更多