乳腺癌早期筛查和诊断生物标志物研究进展

乳腺癌是一种由乳房腺上皮组织发生恶性增生而引发的肿瘤疾病，目前已取代肺癌成为全世界发病率最高的癌症[1]。据2020年《临床医师癌症杂志》(CA：A Cancer Journal for Clinicians)的全球癌症统计报告[2]，当年全球女性乳腺癌新发病例226.141 9万例，死亡病例68.499 6万例，分别占女性癌症新发和死亡总数的24.5%和15.5%。其标化发病率和死亡率分别为4.78/万和1.36/万，0–74岁累计发病和死亡风险分别为5.20%和1.49%。同年Cao等[3]统计指出，我国女性乳腺癌发病率为5.90/万，居全国女性恶性肿瘤发病谱首位(约占中国女性癌症新发病例总数的19.9%)；死亡率为1.66/万，居全国女性恶性肿瘤死亡谱第4位，严重威胁了女性的生理、心理和生命健康。

癌症统计报告显示[4]：诊断为早期乳腺癌患者的相对生存率远高于诊断为晚期乳腺癌患者的相对生存率。诊断为0期和Ⅰ期乳腺癌患者的5年生存率接近100%，Ⅱ期为93%，Ⅲ期为72%。由于乳腺癌的一级预防尚无良策，因此早期发现、早期诊断和早期治疗是降低乳腺癌死亡率及改善预后的关键。

当前，乳腺癌临床诊断的常用方法有组织病理学诊断和影像学诊断。组织病理学诊断是乳腺癌诊断的“金标准”，其病理检查报告通常作为疾病确诊的最终参考。但其获取乳腺组织样本时需要对检查者的身体进行穿刺，会给检查者的身体和心理带来双重负担。影像学诊断包括B超、X光和核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)。其中B超检查简单便捷、对检查者的辐射量小，但由于其诊断表现与乳腺癌的病理分型相关，所以对早期乳腺癌的诊断准确率很差。乳房X光检查是当前乳腺癌筛查的首选方法，但其存在着对致密型乳腺诊断准确率差的缺点。MRI对人类组织的成像效果很好，临床上常作为B超和乳房X光检查的补充方法，因其检查费用昂贵不适用于大范围的早期筛查。因此，亟需开发一种诊断准确率高的无创性乳腺癌诊断方法。

肿瘤生物标志物是指由肿瘤组织或宿主与肿瘤相互作用所产生的一类活性物质，常常存在于血清、细胞、尿液、体液或组织中并能够提示肿瘤存在与生长变化。理想的肿瘤生物标志物应当同时满足3个基本要求[5]，即分析有效性(analytical validity)、临床有效性(clinical validity)和临床可用性(clinical utility)。具体而言，分析有效性要求标志物具备一定的准确性、灵敏度、特异性和稳健度。临床有效性要求标志物可以检测出疾病状态和预测结局。临床可用性要求，与未使用该标志物相比，使用该标志物可以改善患者的结局(在癌症诊断、治疗、管理或预防方面有统计学意义的改善)。随着科技的进步和发展，肿瘤生物标志物已在肿瘤筛查和诊断中发挥重要作用。在已发现的乳腺癌肿瘤生物标志物中糖类抗原15-3 (carbohydrate antigen 15-3, CA15-3)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)主要应用于转移性乳腺癌患者的病程检测[6]，具有较高的应用价值，但同时也存在着诊断灵敏度低和特异性差等缺点。对此，已有许多研究工作致力于在开发出一种新型无创的乳腺癌生物标志物，并将其应用于乳腺癌的早期筛查和诊断，以期降低人群中的乳腺癌死亡率。本文将从无创性肿瘤生物标志物(按血液、尿液、呼出气体和乳头吸出液4种来源划分)在乳腺癌早期筛查和诊断研究领域作一综述。

乳腺癌的组织学表现形式是大量的幼稚化的癌细胞无限增殖和无序状拥挤成团，挤压并侵蚀破坏周围的正常组织，破坏乳房的正常组织结构[7]。在乳腺癌发病初期，腺上皮细胞在多种致癌因子(如雌二醇E2和或孕激素P4等)的共同作用下，会发生基因突变，致使细胞增生失控，由于癌细胞的生物行为发生了改变，呈现出无序、无限制的恶性增生[8]。

传统的乳腺癌诊断筛查方法有B超、X光和MRI。乳房B超检查具有无创、便捷、价格低廉和辐射性低的优点，是妊娠或哺乳期女性检查乳腺癌的首选方法。它显示病灶形态时不受致密型乳腺的影响，且彩色多普勒血流分析对乳腺肿瘤的良、恶性区分很精确。但B超的诊断表现受乳腺癌的病理分型影响很大，还对检查医师的专业素质要求很高，复查时难以获得准确的对比图像，对病灶的诊断定性往往不如乳房X光的重现性好[9]。

乳房X光检查应用最为广泛，是乳腺疾病筛查和诊断的首选方法，对钙化型乳腺癌的显示能力很强，被证明能有效降低乳腺癌的死亡率和改善预后。但它对致密型乳腺和乳腺癌微小病变分辨不清容易漏诊，此外还会给检查者带来辐射和过度诊断的危害，其过度诊断的估计范围为0%至40%−50%[10]。

MRI对人类组织的成像显影效果极佳、诊断灵敏度和准确率较高，且能对B超和乳房X光检查不能确定的乳腺病灶提供诊断依据。在乳腺小病灶、多病灶和多中心性癌灶以及乳腺深层癌灶方面的诊断和评价上具有优势。但它也存在着检查成本高、操作复杂和假阳性高的缺点。

在乳腺癌早期诊断方面，血液检测相较于乳房X光检查和组织活检具有检测成本低、便捷无创和易于大规模筛查等优点，能够在乳腺癌的早期检测中发挥重要作用。此外，癌细胞通常会将其产生的特异性核酸、蛋白质或细胞囊泡等排入到人体血液中，因而分析血液中上述成分的存在可能提供一种检测癌症的方法。下文将围绕血液来源的肿瘤生物标志物展开，包括循环肿瘤细胞DNA (circulating tumor cell DNA, ctDNA)、CEA、CA15-3、细胞外囊泡(extracellular vesicles, EV)、循环miRNA和乳腺癌易感基因(breast susceptibility gene, BRCA)突变等(图 1)。

循环肿瘤细胞DNA (circulating tumor cell DNA, ctDNA)是由肿瘤细胞凋亡、坏死或分泌产生的DNA片段，分类上归属于循环游离DNA (circulating free DNA, cfDNA)，可从人体外周血中获得[11]。通常，ctDNA包含有与起源肿瘤细胞一致的基因突变，如点突变重排和扩增，因而是潜在的疾病诊断生物标志物，有可能作为肿瘤组织切片的补充诊断手段[12]。

ctDNA可用于检测40%−70%的癌症，包括乳腺癌、脑肿瘤、结直肠癌和黑色素瘤等[13]。Yang等[14]发现早期癌症患者的ctDNA浓度(0.77 ng/μL)明显低于晚期癌症患者的ctDNA浓度(1.52 ng/μL) (P=0.014 9)，且ctDNA浓度随癌症分期增加而增加。

1977年，美国的Leon等[15]随机抽取了32名乳腺癌患者和55名健康对照者的外周血液并对其ctDNA水平进行检测，发现乳腺癌症患者血清ctDNA浓度平均值(38 ng/mL)比健康对照者血清ctDNA浓度的平均值(7 ng/mL)高。同样地，Huang等[16]于2006年发现乳腺癌患者的血清DNA浓度(65 ng/mL)要比健康对照组的血清DNA浓度(13 ng/mL)高，且实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)的检测灵敏度为93.4%。2019年，Zhang等[17]研究对比了102名早期乳腺癌患者和50名良性乳腺肿瘤患者的血液ctDNA表达水平，发现将ctDNA与相应的乳腺影像报告和数据系统(breast imaging reporting and data system, BI-RADS)评分相结合时，其对乳腺癌诊断的阳性预测值为92.4%、灵敏度为74.2%、特异性为92.0%，AUC=0.821。以上研究结果证明了ctDNA在乳腺癌筛查诊断中的潜力。

Olsson等[18]回顾性分析了多项有关乳腺癌患者血浆ctDNA表达情况的研究，并从中发现93%发生转移的患者在临床检测前3年内显示出肿瘤特异性ctDNA的证据。相反，在长期无病生存期患者中未检测到ctDNA。同样，Coombes等[19]在一项研究分析中指出，检测乳腺癌患者血浆ctDNA水平能够在89%的复发患者中平均提前8.9个月检测到复发。以上研究结果在一定程度上展示出了ctDNA可作为一种生物标志物用于乳腺癌的早期筛查的潜力。综上所述，虽ctDNA在乳腺癌的诊断工作中具有一定的分析有效性(灵敏度和特异性良好)，但是其临床有效性(不能预测患者结局)和临床可用性(对改善患者结局的作用有限)均存在明显的不足。因此，循环肿瘤DNA作为一种乳腺癌早期筛查的生物标志物时作用有限，但在乳腺癌的转移和复发检测方面有一定作用。

相比于癌蛋白和循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)，ctDNA具有以下优点：一是检测乳腺癌转移和复发的灵敏度高[20]；二是检测动态范围广、特异性强，能指示出肿瘤的异质性特征[21]；三是识别相对早期癌症的能力强[22]。

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)是一种由正常的胎儿肠道组织和上皮肿瘤产生并参与细胞黏附的糖蛋白，于1965年首次被确定为结肠癌抗原[23]。分子生物学上，CEA描述为来自32个基因家族的糖蛋白，能在各种组织中表达。通常，健康成人血浆中CEA水平非常低(＜5 μg/L)，但它在人类多种癌症中过表达(> 20 μg/L)，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌和结直肠癌等，是重要的肿瘤生物标志物之一[24]。

Cui等[25]统计分析了7 510名乳腺癌患者和39 650名健康对照者的血清CEA水平，发现乳腺癌患者的血清CEA水平(平均值2.17、中位数1.67和–lgP=37.85)显著高于健康对照者的CEA水平(平均值1.78、中位数1.55和–lgP= 0.00)。上述研究结果在统计学上证明了CEA在乳腺癌患者和健康者中的表达水平不同。

Mujagić等[26]分别检测了47名乳腺癌患者(实验组Ⅰ)、40名健康对照者(对照组Ⅰ)和33名其他类型的癌症患者(对照组Ⅱ)的平均循环CEA水平。经过t检验和双向方差分析对数据进行分析处理，发现在乳腺癌患者的CEA循环水平显著高于健康女性(P＜0.000 1)和其他癌症患者(P＜0.007)，而其他癌症患者的血清CEA亦显著高于健康对照者(P＜0.01)。其中CEA在乳腺癌筛查诊断的灵敏度和特异性分别为65.0%和57.1%。此外，Jia等[27]研究对比了115名早期乳腺癌患者和69名健康对照者的CEA表达水平，发现早期乳腺癌患者的血清CEA浓度为(20.03 ± 18.15) ng/mL，健康对照者的血清CEA浓度为(11.34 ± 3.65) ng/mL (P＜0.000 1)，其诊断早期乳腺癌的灵敏度和特异性分别为46.1%和79.7%，AUC=0.620。多项研究证明，乳腺癌患者的CEA水平与健康女性之间存在差异[28–30]，由于CEA是一种广谱肿瘤生物标志物，在某些良性肿瘤中的表达量也会升高，缺乏一定的分析有效性(特异性低)，故临床上不推荐作为乳腺癌的早期诊断的标志物，而通常将其作为疗效评价与术后监测转移和复发的指标。

糖类抗原15-3 (carbohydrate antigen 15-3, CA15-3)是MUC1基因的产物，MUC1基因存在于几乎所有上皮细胞中，其高表达通常与结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胰腺癌有关[31]。CA15-3在正常人血清中含量低于30 U/mL[32]。由于CA15-3具有细胞黏附和细胞间相互作用的特性，所以细胞表面MUC1表达的增加往往伴随着癌细胞的侵袭和转移。此外，它对乳腺癌的特异性高于CEA和组织多肽抗原(tissue polypeptide antigen, TPA)，因而在乳腺癌早期发现和诊断具有极其重要的作用。

Bayo等[33]研究对比了63名早期乳腺癌患者和63名健康对照者的CA15-3表达水平，发现早期乳腺癌患者的血清CA15-3浓度为19.74 U/mL，显著高于健康对照者的16.19 U/mL，其诊断早期乳腺癌的灵敏度和特异性分别为85.7%和83.3%。在Fu等[34]的一项研究中，对1 179例乳腺癌患者和493名健康对照者进行了回顾性分析，指出血清中的CA15-3是乳腺癌的潜在生物标志物。他们通过分析发现CA15-3和CEA水平与乳腺癌对恶性肿瘤的易感性有显著关联(CA15-3: SMD=2.15, 95%CI: 2.00−2.30, P=1.8×10−8)，而CA15-3水平与乳腺癌对良性肿瘤的易感性之间没有显著关联(CA15-3: SMD=0.17, 95%CI: 0.21−0.38, P=0.382)。

马玲等[35]对60名乳腺癌患者和40名健康对照者的血清CA15-3水平进行了检测，发现乳腺癌患者的血清CA15-3水平(28.68±4.53) U/mL高于健康对照组的血清CA15-3水平(21.35± 2.88) U/mL，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。其对乳腺癌的灵敏度和特异性分别为88.3%和85.0% (P＜0.001)，AUC曲线下面积为0.910。在另一项研究中，Ali等[36]抽取了30名原发性乳腺癌患者和20名健康对照者的血清，随后使用酶联免疫吸附试验检测血清中的CA15-3，结果发现乳腺癌患者的平均CA15-3水平(79.15± 27.54) U/mL明显高于健康对照组的平均CA15-3水平(24.34±11.68) U/mL (P＜0.05)，对乳腺癌的检测灵敏度为93.3%，特异性为96.6%。

在临床上，CA15-3在乳腺癌患者术前的预后评估、术后的病情监测和疗效评估等方面应用价值更高。当同时与其他指标或影像学检测联合诊断时，才可用于鉴别诊断乳腺癌。从肿瘤生物标志物的3个基本要求考虑，限制其应用在早期乳腺癌诊断的原因为，一是分析有效性差：CA15-3缺乏足够的灵敏度和特异性，对早期乳腺癌的阳性率低，而对晚期乳腺癌和转移性乳腺癌的阳性率较高。MUC1几乎在所有上皮细胞中表达，故CA15-3水平的升高并不仅仅与乳腺癌有关；二是临床有效性低：CA15-3的水平升高除了与肿瘤发生、发展相关外，还受到生理状态、良性疾病、炎症、检测因素等多种因素影响，容易出现“假阳性”结果。

细胞外囊泡(extracellular vesicles, EV)是一种携带有各种蛋白质、脂质、核酸(RNA和DNA)和代谢物的由细胞释放的囊泡[37]，为一类脂质膜封闭的亚细胞结构[38]。EV通常分为3大类[39]：从细胞凋亡经历细胞中释放为泡泡的凋亡体(直径1 μm)，来自内体和多泡体与质膜融合的外泌体(直径10−200 nm)，以及通过质膜向外萌芽和裂变产生的微囊泡(直径30−300 nm)。不同类别的囊泡通过不同的机制释放[40]，外泌体通过Rab27a/b通路通过多泡体的胞吐作用释放，而凋亡体和微囊泡则由质膜的浸出释放。

细胞外囊泡特别是外泌体是细胞间通讯的重要介质，在生理学上，EV有助于体内平衡并促进宿主防御机制，包括止血和炎症[37]；而在病理学中，癌细胞分泌的EV量远高于健康细胞，在癌症患者的血浆以及肿瘤细胞培养物中可检测到更多数量的EV[41]，可见EV有潜力成为各种癌症的筛查和诊断标志物[42–44]。

分析EV中包含的癌症相关内容可以帮助诊断乳腺癌，特别是已知肿瘤来源的EV携带致癌miRNA，它们可以通过分析血液中循环的EV-miRNA的表达水平用于诊断早期癌症[45]。多项研究结果表明：从乳腺癌患者血浆中分离得到的EV中存在多种不同的肿瘤生物标志物，如局灶性黏附激酶(focal adhesion kinase, FAK)、表皮生长因子受体蛋白[46]、凋亡抑制基因[47]等。因此，分析EV中含有的生物标志物可以帮助乳腺癌早期诊断，并将乳腺癌与良性和非癌性疾病区分开来。

Kim等[45]从癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)数据库中选择了7种来自EV的miRNA用于验证肿瘤衍生的EV (tumor-derived EV, TDE)中miRNA的表达水平，样本来自55名早期乳腺癌患者和20名健康对照者。发现其中的4种miRNA (miR-9, miR-16, miR-21和miR-429)的表达水平在早期乳腺癌患者中显著升高。这4种miRNA的组合用于乳腺癌早期诊断具有高灵敏度(96.8%)和特异性(80.0%)，AUC=0.880 (95%CI: 0.78−0.99)，优于目前的诊断方法，具备一定的分析有效性。其中，miR-16在区分乳腺癌患者和健康对照者方面具有最佳的鉴别能力，AUC=0.850 (95%CI: 0.77−0.94)，其次是miR-21 (AUC, 0.700; 95%CI: 0.56−0.82)，miR-9 (AUC, 0.710: 95%CI: 0.59−0.82)和miR-429 (AUC, 0.710: 95%CI: 0.60−0.83)。

与直接暴露在血清中的miRNA相比，EV中所含的miRNA在血浆中的半衰期更长，因为EV的脂质膜保护miRNA免受核糖核酸酶降解。此外，TDE及其内含物对癌细胞具有高度特异性，因为它们反映了起源的特征。因此，基于miRNA表达模式分析，含miRNA的EV被提出作为癌症诊断的理想来源。另一方面，与传统的组织活检相比，EV具有侵入性较小，可检测早期无症状癌症的优势。综上所述，细胞外囊泡有助于提高癌症诊断准确性和辅助指导后续治疗决策，但也存在着预测患者结局(临床有效性)和改善患者治疗(临床可用性)方面的不足。

miRNA (microRNA)是一类长度为20−30个核糖核苷酸的短链非编码RNA，具有控制蛋白质翻译和/或影响信使RNA (mRNA)稳定性的能力[48]。在细胞存活、分化、衰老、凋亡、致癌和转移等方面中起着至关重要的作用。

Shimomur等[49]从国家癌症中心随机抽取了1 280名乳腺癌患者(实验组Ⅰ)、2 836名非癌症对照者(对照组Ⅰ)、451名其他类型的癌症患者(对照组Ⅱ)和63名非乳腺良性疾病患者(对照组Ⅲ)的血清样品，使用高灵敏度的微阵列分析全面评估了血清miRNA表达谱。在对比乳腺癌和非乳腺癌患者中的miRNA表达后发现：特定的5个miRNA的组合(miR-1246, miR-1307-3p, miR-4634, miR-6861-5p和miR-6875-5p)用于检测乳腺癌效果最好。该组合在实验组Ⅰ中诊断的灵敏度为97.3%，特异性为82.9%，准确性为89.7%。此外，该组合可以检测早期乳腺癌(对Tis的灵敏度为98.0%)。Zou等[50-51]亦发现由几种不同的miRNA构成的特定集合可以用于乳腺癌的早期诊断。

因为乳腺癌具有高度异质性，对不同分期的miRNA表达谱也有所不同[52]。Yu等[53]使用RT-qPCR研究了来自113名早期乳腺癌患者和47名健康对照者血清样本中miRNA的表达水平，发现miR-21-3p、miR-21-5p和miR-99a-5p这3种miRNA的组合具有最佳的辅助诊断效果，其诊断早期乳腺癌的灵敏度和特异性分别为97.9%和73.5%，AUC=0.895。此外，Kim等[45]开发了一个用于检测早期乳腺癌的miRNA组合(miR-9, miR-16, miR-21和miR-429)，其具有高灵敏度(96.8%)和特异性(80.0%)，AUC=0.880。Agelaki等[54]评估了参与肿瘤休眠的miR-23b和miR-190，参与晚期转移的miR-21以及参与上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的miR-200b和miR-200c等在早期和晚期转移性乳腺癌患者的血浆中表达。并从辅助或一线治疗前分别从84名早期乳腺癌患者和57名转移性乳腺癌患者中获取血浆样本，用RT-qPCR评估上述5种miRNA的表达水平，根据中位值将表达分为高或低。与早期乳腺癌患者相比，miR-21 (AUC=0.772; P＜0.001), miR-23b (AUC=0.625; P=0.012), miR-200b (AUC=0.744; P＜0.001)和miR-200c (AUC=0.668; P=0.001)更高，而miR-190 (AUC=0.629; P=0.013)较低，可以区分早期乳腺癌患者和晚期转移性乳腺癌患者，具有一定的临床有效性。综上所述，miRNA在乳腺癌的诊断工作中具有相当的分析有效性、临床有效性和临床可用性。

研究发现表明，许多miRNA能够特异性地调节乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells, BCSC)的靶基因表达和信号通路[54]。它们在乳腺癌细胞的自我更新、生长和转移中起着重要的作用，可作为肿瘤发展、转移和对治疗反应的潜在诊断标志物。例如，miR-24-3p和miR-125b-5p均被确定为早期发现[55]，预后[56]或预测复发的潜在乳腺癌生物标志物[57-58]。因此，差异表达的循环miRNA组合是乳腺癌早期检测的潜在生物标志物。

乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene 1, BRCA1)和乳腺癌易感基因2 (breast cancer susceptibility gene 2, BRCA2)是一种抑癌基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用。当其突变或表观遗传失活时将导致BRCA1/2表达降低，乳腺分化受损，进而使患乳腺癌风险增加。

2019年，Deng等[59]研究对比了2 769名乳腺癌患者血液DNA中的BRCA1/2突变水平，发现乳腺癌患者的BRCA1、BRCA2和PALB2突变率很低，分别为2.7% (n=74)、2.7% (n=76)和0.9% (n=24)。上述研究表明，乳腺癌与BRCA1/2突变无强关联性，BRCA突变用于乳腺癌早期诊断意义不大。2016年，Yao等[60]研究对比了1 816名乳腺癌患者和5 549名对应患者家族亲属的血液BRCA1/2突变水平，在前者中鉴定出125例BRCA1/2致病突变，在后者中鉴定出206例乳腺癌。患者家族亲属的BRCA1突变携带者、BRCA2突变携带者和非携带者的乳腺癌发病率分别为11.0%、12.7%和3.2%。研究表明BRCA1/2突变携带者的患者家族亲属患乳腺癌的风险显著高于非携带者的亲属，可用于高风险病人的查找。BRCA1突变携带者与非携带者，风险比(RR)=3.77, 95% CI; 2.34−6.09, P＜0.001；BRCA2突变携带者与非携带者，RR=4.42, 95%CI: 2.70−7.25, P＜0.001。同样，美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)不推荐对普通人群进行BRCA突变检测，仅建议BRCA突变检测用于识别患乳腺癌的高风险人群(乳腺癌患者家族亲属)，并进一步帮助其主动预防疾病的发生。对乳腺癌患者而言，BRCA1/2基因突变检测诸多优点：可以帮助阳性患者选择适宜的手术治疗方案(更倾向于选择乳腺全切，而不是保留乳房)，指导其选择疗效更好的化疗药物(铂类药物)和预后监测复发(复查部位不仅局限于乳腺，还应包括卵巢及输卵管)。

2018年，Lancet刊发了Copson等[61]的一项研究，追踪随访了15年2 733名乳腺癌患者血液DNA中的BRCA1/2突变水平，发现共有338例(12%)患者检测出BRCA突变，BRCA阳性和BRCA阴性患者的5年和10年总生存期均无统计学意义差异(5年：83.8% vs. 85.0%; 10年：73.4% vs. 70.1%; P=0.76)，上述结果表明乳腺癌基因并不会增加患者死亡率。因此，BRCA突变检测或存在局限性，即对于检测出BRCA突变的年轻女性而言，需要谨慎考虑是否有必要进行预防性手术切乳(无论答案如何，都将给检测者带来一定的心理负担或生理创伤)。

除血液来源的生物标志物外，乳腺癌患者尿液、呼出气体和乳头吸出液来源的生物标志物也被发现具有乳腺癌早期诊断的潜力(图 1)。

人体尿液是常规医学检测中最为便捷的生物液体之一。多项研究表明，尿液含有乳腺癌筛查的潜在生物标志物，其分析手段涵盖了代谢组学分析、蛋白质组学分析和外泌体分析等[62–64]。

Mistry等[65]使用代谢组学分析的手段成功在乳腺癌组织中观察到磷脂代谢增加，特别是磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)或其他前体分子。此外，Moreau等[66]从分子机制上证明了野生型BRCA1等位基因的缺失会导致乳腺癌细胞中的脂质产量增加。Kim等[67]从3组不同类别的患者(健康对照组和乳腺癌患者手术前后)中提取尿磷脂(urinary phospholipids, UPLs)，然后对其进行nLC-ESI-MS-MS分析。结果发现：乳腺癌患者尿液样本的PC和PE的总浓度比健康对照组分别增加了44.0%和71.0%。以上研究均证明了检测尿液中磷脂含量有助于早期乳腺癌的早期筛查。

2015年，Erbes等[68]发现构建特定的尿液miRNA谱(miR-21、miR-125b、miR-155和miR-451)可以将乳腺癌患者与健康对照组分开，其诊断早期乳腺癌的灵敏度和特异性分别为83.3%、87.5% (P＜0.001)，AUC=0.887。Hirschfeld等[69]研究探讨了69名乳腺癌患者和40名健康对照组的病例，并发现了尿液外泌体miRNA具有相当的诊断潜力，他们确定了由4种尿miRNA类型(miR-424, miR-423, miR-660和let7-i)组成的特定小组，可以区分乳腺癌患者和健康对照组，灵敏度为98.6%，特异性为100%。以上均证实了早期乳腺癌患者与健康对照者的尿液miRNA谱不同，说明其具有一定的分析有效性和临床可用性，但同时也存在着临床有效性(准确预测患者结局)的不足。

尿液蛋白质组学可供挖掘的信息量很大，已成功用于发现癌症诊断和监测的新标志物[62, 70-72]。将此项技术与尿液筛查相结合，有助于增加对癌症患者病程状态的了解，并进一步协助临床实践中的评估和治疗。Beretov等[73]的一项研究分析显示，相比于健康对照组，乳腺癌患者组中有59种尿蛋白差异显著(P＜0.05，倍数变化 > 3)，并且其中的36种尿蛋白与乳腺癌的分期密切相关。作者经多轮重复验证发现，亮氨酸重复蛋白36 (leucine rich repeat containing protein 36, LRC36)、丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员4 (microtubule associated serine/threonine kinase family member 4, MAST4)、糖化血红蛋白(glycated hemoglobin, HBA)和组织多聚蛋白2 (Multimerin 2, MMRN2)等13种上调蛋白所构成的分析组可用于乳腺癌检测。

尿液也是外泌体的来源之一。Ando等[74]从22名乳腺癌患者和26名健康女性中分离出尿液外泌体，并通过RT-qPCR测定分离的外泌体中miR-21和基质金属蛋白酶-1 (MMP-1)的表达。他们发现，尿液外泌体衍生的miR-21和MMP-1的表达可以作为癌症检测的诊断标志物，其综合灵敏度为95.0%，特异性为79.0%。

尿液标本具有留取方便和无创等优点，有望成为疾病临床诊断、预后及大规模人群筛查的理想媒介。此外，尿液中所含的生物代谢物、miRNA、蛋白质或其他细胞成分含量的变化均与乳腺癌的形成和发展密切相关，具备诊断早期乳腺癌的潜力。

呼出气体中含有挥发性有机化合物(volatile organic compounds, VOCs)和半挥发性化合物，数量在1 000种以上，它们与人体中的正常新陈代谢和其他病理性生化反应密切相关[75]。有研究表明，癌细胞的存在会影响呼气中化学物质的特性和丰度，其可以作为肿瘤辅助诊断的标志物[76]。呼气挥发性生物标志物的检测和分析被认为是癌症诊断和健康检查的新领域[77]，包括用于乳腺癌、肺癌和胃肠道癌[78–80]。

在一项研究中，Phillips等[81]对51名乳腺癌患者和42名健康对照者进行了VOCs检测，发现一个由5种VOCs构成的组合(2-丙醇、2, 3-二氢-1-苯基-4(1H)-喹唑啉酮、1-苯基乙酮、庚醛和肉豆蔻酸异丙酯)具有检测乳腺癌疾病的能力，其诊断的灵敏度和特异性分别为93.8%和84.6%。

在另一项研究中，宋琪等[82]使用固相微萃取-气相质谱/质谱联用技术对呼气中VOCs进行检测，在33例乳腺癌患者、27例乳腺病患者和36例正常人的呼气中VOCs测试中筛出苯乙酮和十六烷2种挥发性标志物，在用于乳腺癌诊断时苯乙酮的灵敏度和特异性分别为97.0%和50.0%，十六烷的灵敏度和特异性分别为75.8%和61.1%，并且两者的浓度差异均有统计学意义(P＜0.05)。初步证实了VOCs具有区分乳腺癌患者和健康对照者的能力。

Yang等[83]采用随机森林模型，试验组乳腺癌的预测准确率为91.0% (95%CI: 0.85−0.95)，灵敏度为86.0%，特异性为97.0%，阳性预测值为97.0%，阴性预测值为97.0%，受试者工作曲线下面积为0.990 (95%CI: 0.99−1.00)，通过kappa值测量的预测可靠性为0.83。乳腺癌分子表型的交叉验证辨别准确度和可靠性分别为88.5%±12.1%和0.77±0.23。该研究展示了VOCs试验具有较高的有效性和可靠性。

综上所述，VOCs试验具有便捷、无创、检测成本低和检测准确率高的特点，在乳腺癌早期筛查中具有广阔的应用前景，并且有望在各级中小医疗机构中普及。

乳头吸出液(nipple aspirate fluid, NAF)是一种乳腺特异性近端液体，由非哺乳期成年女性乳房中的导管-小叶系统自然分泌[84]，绝经前和绝经后女性均可通过乳房按摩、吸乳泵或催产素鼻喷雾获得，其成功率在34%−90%之间[85–87]。它含有丰富的蛋白质、激素、脂质和碳水化合物，一般从细胞碎片、导管和小叶上皮脱落，被认为是生理和病理条件下乳腺微环境中发生的细胞变化镜像[88]。另一方面，由于绝大多数乳腺癌病例起源于导管-小叶系统内衬的上皮细胞，因此NAF是癌变前和癌变后的理想生物标志物来源，为乳腺癌的早期筛查提供了有益的参考。

一项研究表明颜色为红色或棕色的NAF在导管原位癌的乳房中比非典型增生更常见(P=0.008)[89]，该模型在预测乳腺癌状态方面的灵敏度为92.0%，特异性为61.0%。该项研究结果在一定程度上揭示了NAF颜色用于乳腺癌评估中的有效性。NAF中存在癌症蛋白质和miRNA等多种生物标志物，其表达谱在乳腺癌患者和健康对照者中存在差异[90-91]。Pawlik等[92]研究了18名低浸润性乳腺癌(早期乳腺癌)女性和4名健康对照组的NAF，并通过蛋白质组学分析发现了39种在含瘤乳房和无病乳房之间差异表达的蛋白质。Oda等[93]研究对比了26名早期乳腺癌患者和63名健康对照者NAF中的DJ-1蛋白(PARK7基因编码的肽酶C56蛋白家族的一员)浓度，发现早期乳腺癌患者的DJ-1蛋白浓度为18.6 ng/mL，显著高于健康对照组中的2.7 ng/mL，其诊断早期乳腺癌的灵敏度为75.0%、特异性为85.9% (P＜0.000 1)。

NAF也是miRNA的来源之一，并且比血清含有更多的miRNA种类[94]。Zhang等[95]研究揭示了导管内乳头状瘤患者乳头排出物中miRNA的差异表达，并确定miRNA作为原发性乳腺癌的新型潜在生物标志物。他们从3名导管内癌乳腺癌患者和3名导管内乳头状瘤患者中收集乳头溢液样本，先使用微阵列扫描仪对miRNA表达进行初步筛选，随后通过RT-qPCR对21个验证样品(8个恶性肿瘤和13个良性肿瘤)中进一步检查了选自初始筛选的miRNA的表达水平。最后结果显示，导管内癌乳腺癌患者组中3个miRNA (miR-4484, miR-K12-5-5p和miR-3646)相比乳头状瘤组显著上调，且RT-qPCR分析证实了4个miRNA (miR-4484、miR-K12-5-5p、miR-3646和miR-4732-5p)可能作为乳腺癌检测的潜在肿瘤生物标志物。

使用NAF作为检测早期乳腺癌发生的生物标志物具有诸多优势：因为NAF由靠近乳腺导管内层的细胞产生，这些细胞与85%的乳房恶性肿瘤相关，更靠近病灶和靶细胞，相比更远的液体(如血清和血浆)能更好地代表局部病理过程，是开发筛查诊断工具的理想液体活检；NAF检测还能提供患者“内部”对照，即将同一女性的患病乳房和另一健康乳房进行自体对照；NAF通过催产素辅助的真空抽吸以无创方式获得，与其他乳腺癌筛查程序如乳房X光检查和磁共振成像相比，不适感更轻；可作为成像的辅助诊断工具，即当成像不太可靠时(成像中存在假阳性可能)或不建议成像时(例如在怀孕和哺乳期间)使用；与血液或尿液相比，NAF的生物标志物浓缩更高，样品的分析质量也就更好，不存在大量稀释而降低组织衍生蛋白质的检测灵敏度的影响；与组织样本相比，NAF不需要进一步分离提取，样品制备分析步骤更为简单。NAF体积小、蛋白质浓度高，足以使用先进的质谱技术进行重复分析。虽然NAF具有一定的灵敏度和特异性满足了对分析有效性的要求，也能够在一定程度上检测出早期乳腺癌的疾病状态，但是其在预测结局(临床有效性)和改善患者结局(临床有效性)方面还存在不足，不能作为乳腺癌预后监测和治疗有效标志物。

乳腺癌是全球女性中最常见的癌症，每年影响210万女性，是100多个国家女性癌症相关死亡的主要原因。研究表明罹患早期非转移性乳腺癌的患者治愈率为70%−80%，而被诊断为远处器官转移晚期乳腺癌患者尚无公认有效的治疗方法，因此早诊断、早治疗是降低人群中乳腺癌死亡率的关键，开发出一种新型有效的生物标志物对乳腺癌早期筛查和诊断意义重大。本综述总结了乳腺癌早期筛查和诊断生物标志物的研究进展(表 1)。

CA15-3和CEA是乳腺癌生物标志物中应用价值较高的肿瘤生物标志物，但由于其对局部病变的灵敏度较低和特异性较差(表 1)，通常需要将二者联合应用以提高检测癌症复发和转移的灵敏度。ctDNA和miRNA，特别是EV中和肿瘤相关的miRNA具有更长的半衰期和更高的特异性，在早期乳腺癌检测方面具有巨大的前景(表 1)。由于NAF靠近疾病区域，并且乳腺癌特异性分子在NAF中的浓度要比其他循环体液高得多，因此从理论上讲，NAF可能是开发乳腺癌早期筛查和诊断工具的理想液体来源(表 1)。此外，呼气检测操作快捷无创价廉，并且可能在相对较早的阶段检测到癌症，未来很有希望在各级医疗机构使用中普及使用。VOCs测试与乳房X光检查相结合，将显著减少乳房X光检查的假阳性和假阴性诊断概率。遗憾的是，目前并没有真正可用于乳腺癌早期筛查和诊断的生物标志物。一方面，由于肿瘤生物标志物具有多样性和复杂性，同一肿瘤可产生多种生物标志物，不同肿瘤亦细胞可产生相同的生物标志物，若只对单一肿瘤生物标志物进行检测，极易出现误诊或漏诊，缺乏一定的临床有效性和临床可用性；另一方面，由于乳腺癌在组织学、流行病学和分子特性层面是一种高度异质性的疾病。乳腺癌亚克隆肿瘤细胞异质性的存在，导致单一的生物标志物在诊断中会产生高低不一的敏感性和特异性，降低了其在乳腺癌筛查和诊断中的分析有效性。综上所述，由于生物标志物的多样性和复杂性以及乳腺癌肿瘤的高度异质性原因，本文中任何一个生物标志物都不能够同时满足肿瘤生物标志物对分析有效性、临床有效性和临床可用性的3个基本要求。因此，发现新型有效的生物标志物并阐明其作用机制有助于肿瘤生物标志物的临床应用。

理想的生物标志物要求具有较强的特异性，并能够在乳腺癌发生的早期阶段被检测到。2020年，Garrido-Cano等[96]研究了125名乳腺癌患者和193名健康对照者的血液miR-99a-5p水平，发现乳腺癌患者的血浆中的miR-99a-5p水平(median, 95%CI: 21.02, 15.26−28.79)比健康对照者的miR-99a-5p水平(median, 95%CI: 7.09, 5.03−9.65)显著高表达。且在使用12.75的最佳临界值下，其诊断乳腺癌的准确率、敏感性和特异性分别为66.7%、68.8%和65.2%，AUC=0.691 (P＜0.000 1)。虽然单一标志物的诊断效果不佳，但多类型生物标志物的联合检测、不同诊断方法的联合使用，可能成为解决上述问题的理想方法[97-98]。如Cui等[98]通过对1 368例早期乳腺癌患者和849名健康者的双变量随机效应meta分析发现，多种miRNA的组合(AUC，灵敏度和特异性分别为0.952，87.0%和88.0%)要比基于单个miRNA的测定具有更高的准确性(灵敏度、特异性和AUC分别为79.0%、77.0%和0.892)。此外，Oncotype DX[99]，即乳腺癌21基因检测，通过检测16个肿瘤相关基因和5个内参基因的表达情况，将检测结果量化为复发评分(RS)，为乳腺癌患者提供预测预后、复发、转移乃至指导治疗等信息，帮助其选择理想的个体化治疗方案。RS从0到100，分数越高，复发的可能性越大，也越能从化疗中获益。在2018年更新的美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer, AJCC)第8版中，Oncotype DX成为唯一一种优先级最高的基因检测方法。

针对现有乳腺癌生物标志物体外诊断方法，需要将其进行规范化和标准化，确保提供准确和可靠的方法。具体而言，要对特定生物标志物的样本类型、样品处理、分析方案、临界值和检测流程进行规范化和标准化。目前，B超、X光和MRI是乳腺癌诊断工作中应用最多的原位技术，但存在B超对早期乳腺癌的诊断准确率较差、X光对致密型乳腺诊断准确率较差以及MRI检查费用较为昂贵等不足。乳腺癌早期诊断效果的提高，离不开诊断技术的进步。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交、利用荧光显微镜观察(细胞、组织)细胞核彩色探针信号、获得特定DNA靶序列结构和数目的信息。2021年，朱晓莹等[100]采用IHC法和FISH法分别检测120例乳腺癌患者石蜡标本中HER-2蛋白表达与基因扩增情况，发现IHC 33例阳性(3+)中FISH检测阳性33例，阳性符合率100%；IHC 61例不确定(2+)中FISH检测阳性24例，阳性符合率39.3%；IHC 26例阴性(0/1+)中FISH检测阴性21例，阴性符合率80.7%。除IHC(2+)的阳性符合率较低(39.3%)外，IHC检测HER-2蛋白表达与FISH检测HER-2基因扩增有较好的一致性(P＜0.05)。FISH具有安全性高、通量高、稳定性高、灵敏度高和特异性高等优点。更重要的是，FISH在NCCN乳腺癌指南中被推荐为HER-2基因检测的金标准。基于FISH的肿瘤原位诊断技术是未来的重要发展方向，但仍需进一步提升其杂交效率。

人工智能和深度学习在各领域已大放异彩，将两者应用在医学影像学诊断不仅能帮助患者更快速地完成包括X线、超声、MRI等检测，同时还可以帮助影像医师提升读片效率，降低误诊概率，并通过提示可能的副作用来辅助诊断。因此，将人工智能和深度学习等前沿技术赋能于影像学诊断将是未来发展的重要方向。在2016年举办的国际生物医学成像研讨会(International Symposium on Biomedical Imaging, ISBI)上，基于深度学习的人工智能算法的诊断性能可媲美熟练病理医师，其诊断乳腺癌前哨淋巴结转移的准确度高达99.5%。2022年，Witowski等[101]对21 537次双侧乳房动态对比增强磁共振成像结果(dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging, DCE-MRI)建立了DCE-MRI人工智能深度学习系统模型。结果发现，在3 936次双侧乳房动态DCE-MRI的测试组中，该系统受试者工作特性曲线AUROC=0.920 (95%CI: 0.92−0.93)，具备良好的乳腺癌诊断性能。综上，人工智能深度学习系统可显著提高MRI用于乳腺癌诊断的准确率，并进一步减少误诊和不必要的活检。

此外，多组学测序技术及数据分析增加了我们对乳腺癌的了解，有助于开发出新型有效的癌症早期诊断生物标志物。Huang等[102]通过研究56名早期乳腺癌患者和61名健康对照者中的血清代谢组水平，并将其RNA高通量测序(RNA-sequencing, RNA-seq)结果与TCGA进行联合分析，发现两条在乳腺癌早期诊断中的关键代谢通路模型(牛磺酸和次牛磺酸代谢途径，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径)，其诊断早期乳腺癌的灵敏度和特异性分别为95.4%和91.8%，AUC=0.934。

随着中国经济和社会的快速发展，人们普遍追求更加健康、长寿的生活，因此降低甚至是消灭影响我国女性健康的头号杀手⎯乳腺癌已经成为人们的共识。因乳腺癌具有高度异质性的特点，早期筛查和诊断对于提高治疗成功率和降低死亡率至关重要。开发一种灵敏度高、特异性强的无创性乳腺癌生物标志物将是该领域的发展方向。