胚胎形态发生素Nodal在结肠腺癌中的表达及其临床病理意义

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1、目录 1胚胎形态发生素N o d a l在结肠腺癌中的表达及其临床病理意 1 1中文摘要 1 1 2英文摘要 4 1 4材料与方法 1 1 1 5结果 一 2 5 1 6讨论 2 9 1 7结论 3 4 1 8参考文献 3 5 1 9英汉缩略词对照表 4 1 2致谢 4 2 3 形态发生素N o d a l分子与肿瘤的关系( 综述) 4 3 附彩图 5 9 胚胎形态发生素N o d a l在结肠腺癌中的表达 及其临床病理意义 摘要 研究背景及目的胚胎形态发生素N o d a l是胚胎发育过程中一个重要的调 节因子，也是转化生长因子p ( T r a n s f o H I lin gg r o

2、 毗hf k t o r - p ，T G F p ) 超家族 的成员之一。作为诱导早期胚胎信号的关键成分，N o d a l参与了中胚层和 内胚层之间的形成、前后体轴位置的确定和左右体轴不对称发育等一系列 关键性事件，对脊椎动物的早期发育有重要作用【1 。3 1 。正常情况下，N o d a l 的表达主要局限于胚胎组织，包括滋养层细胞，增生期子宫内膜和发育中 的乳腺等组织，而正常人体发育成熟的组织中不表达或仅有极低的表达 【4 - 6 】。随着研究的深入，更多研究发现N o d a l在多种人类恶性肿瘤如恶性 黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌中重新表达【7 一，它具有促进肿瘤 细胞生长、

3、侵袭和转移的作用，但N o d a l在结肠腺癌中是否表达尚不清楚。 转移是恶性肿瘤重要特性之一，转移的机制可能有上皮一间质转化 ( E p it h e lia lM e s e n ch y m a lT r a J ls it io n ，E M T ) 【1 0 】，细胞黏附( C e UA d h e s io n ) 的改变和细胞发生迁移。研究表明，转移的发生与胚胎干细胞相关基因上 调有关，其中N o d a l就是促进早期浸润性事件发生的关键性胚胎因素，而 上皮钙连接素( E p it h e lia lca d h e r in s ，E ca d lle r in ) 是上皮

4、一间质转化中非 常重要的蛋白。细胞增殖核抗原( K i6 7 ) 能较好的反应肿瘤细胞的增殖状 态，其标记指数与肿瘤的恶性程度、侵袭转移能力及预后高度相关，因此， 它已被广泛地应用于测定各种肿瘤细胞的增殖活性【1 2 。4 】。为此本研究目的 为：1 免疫组化检测N o d a l分别在正常结肠黏膜、结肠腺瘤及结肠腺癌组 织中是否表达；2 N o d a l在三种组织中的表达情况是否存在差异，以及 N o d a l，E c础e r in 和K i6 7 的表达与结肠腺癌患者的临床病理特征是否有 关；3 用W e s t e mB lo t 方法检测正常结肠黏膜和结肠腺癌组织中N o d a

5、l蛋 白的表达，其结果是否与免疫组织化学检测方法结论一致。 材料及方法 1 免疫组织化学( im m u n o h is t o ch e m is 时，m C ) E n V is io n 法 查阅泸州医学院附属医院病理科2 0 1 2 年1 月至2 0 1 2 年9 月的存档 资料，筛选出结肠腺癌lo o 例，结肠腺瘤2 3 例，正常结肠粘膜2 3 例( 均 为结肠腺癌根治术中肿瘤远端切缘) 。所有病例均经过泸州医学院病理 科两位高年资病理医生盲法确诊。 通过入院病历、手术记录、检查报告单及相应的所有皿病理切片 收集患者的相关资料，包括年龄、性别、临床D u k e s 分期、肿瘤分化

6、程 度、浸润深度以及淋巴结转移情况，并记录。 将上述1 4 6 例病人对应的组织切片，并进行免疫组织化学染色，所 用抗体包括N o d a I ，E ca d h e r in 和K i6 7 。 2 蛋白免疫印迹( W - e s t e mB 1 0 t ) 从2 0 1 3 年4 月2 5 日开始到泸州医学院附属医院手术室收取新鲜结肠 黏膜组织，主要为结肠腺癌根治术中切下的结肠腺癌肿瘤组织和肿瘤远端 结肠组织，共1 6 例。用W r e s t e mB lo t 检测所有1 6 例新鲜组织中N o d “蛋 白的表达。 结果 1 I H C 结果显示N o d a l在结肠腺癌中的阳性

7、表达较其正常结肠黏膜和结肠 腺瘤组织中的表达明显增高，其阳性率分别为正常结肠黏膜组织4 3 5 ， 结肠腺瘤6 5 2 ，结肠腺癌组织9 7 ( 尸 O 0 0 1 ) 。 2 对1 0 0 例结肠腺癌I H C 切片进行相关性分析发现，N o d a l的表达与肿瘤 分化程度( 严O 3 6 2 ，尸 O 0 0 1 ) ，浸润深度( 严O 3 5 0 ，尸 O 0 0 1 ) 及D u k e s 分期( 严O 2 5 3 ，P = O 0 1 1 ) 呈正相关，且在结肠腺癌组织中，N o d 2 L l与 E ca d h e r in 的表达呈负相关( 严一O 2 6 4 ，尸：O 0

8、 0 8 ) ；与K i6 7 的表达呈正 相关( 严O 2 5 1 ，尸= O 0 1 2 ) 。 3 W e s t e mB lo t 结果显示，N o d a l蛋白在结肠腺癌组织中的表达明显高于相 应的正常切缘黏膜组织，此结果与I H C 结果一致。 结论 1 本实验表明，N o d a l在正常结肠黏膜组织和结肠腺瘤组织中低表达，而 在结肠腺癌组织中高表达。 2 N o d a l的表达与肿瘤分化程度、浸润深度及D u l( e s 分期有关，表明N o d a l 的表达可能增加了结肠腺癌细胞的侵袭和转移能力。 3 与E ca d h e r in 和飚6 7 的相关分析提示，N

9、 o d a l可能有促进结肠腺癌细胞 增殖和转移的能力。 4 对N o d a l蛋白进行检测有望成为结肠腺癌临床诊断、分级、分期等的一 项新指标，还可能为临床提供治疗方案和判断预后提供参考。 关键词：N o d a l；胚胎形态发生素；结肠；肿瘤；E ca d h e 血；K i6 7 ； 免疫组织化学；W r e s t e mB lo t T h e C lin ico p a t h o lo g ica lS ig n if ica n ce so f t h eE m b r y o n ic M o r p h o g e n N o d a IE x p r e s s io

10、 ninC o lo na d e n o ca r cin o m a A b s t r a ct O b j e ct iv e7 r h ee m b 叫o n icm o 印h o g e nN o d a l，am e m b e ro ft r a n s f o r m in g g r o 叭hf a ct o r _ p ( T G F - p ) s u p e r f a m ily ，w a sa nim p o r t a n tr e g u la t o 巧f a ct o r d u r in ge m b 巧o g e n e s is A sak e yc

11、o m p o n e n to ft h ein d u ce ds ig n a lint h ee a r ly e m b 巧o ，N o d a lp la y e da nim p o r t a n tr o le ine a r lyV e r t e b r a t ed e V e lo p m e n t ， in clu d in g t h ed e t e m lin a t io no f仔o n ta n dr e a ra X is p o s it io n a n dt h e s p e cif ica t io no f1 e R r i曲ta s y

12、 m m e t r y ，a sw e ll a st h ef o m la t io no fm e s o d e n n a n de n d o d e llm 【1 - 3 1 I nh u n la n s ，N o d a l e x p r e s s io nw a sla 玛e ly r e s t r ict e dt o e m b 巧o n ict is s u e s ，in clu d in gt h et r o p h o b la s ta n dt h ed e V e l叩in gm a m m a r y 9 1 a n da n do v 哪b

13、u tw a sg e n e r a llylo s to ro n lyV e 巧lo we X p r e s s io ninn o m a l a d u ltt is s u e s 【4 6 1 1 1 1r e ce n ty e a r s ，m o r ea n dm o r es t u d yf o u n dt h a tN o d a l r e - e X p r e s s e dinaV 撕e 够。仆u m a nm a lig n a n cie s ，s u cha sm a lig n a n tm e la n o m a ， p r o s t a

14、t eca n ce r ，b r e a s tca n ce ra n dp a n cr e a t ic ca n ce r 7 9 1 ，w h ichw a sacr it ica l p r o m o t ef I a ct o rf o rt h et u m o r ig e n ici吼in V a s io na n dm e t a s t a s iso f t u m o rce ll N o wN o d a l e x p r e s s io n inco lo na d e n o ca r cin o m aw a su n cle a r T h e

15、m e ch a n is m so fm e t a s t a s isin clu d e de p it h e lia l m e s e n ch y m a l t r a n s it io n ( E M T ) ， a lt e r a t io n since llu la ra d h e s io na n dm ig r a t io n ，w h ichw a so n eo ft h eim p o r t a m ch a r a ct e r is t icso fm a lig n a n tt u m o r s S t u d ie sh a v es

16、 h o w nt h a tt h ist r a n s it io n w a sa s s o cia t e dw it ha nu p r e g u la t io no fe m b 巧o n ics t e mce ll一a s s o cia t e dg e n e s 4 N o d a lw a sa ne m b 叫o n icf a ct o rt h a tp la y e dacr it ica lr o leinp r o m o t in ge a r ly in V a s iV ee V e n t s d u r in gd e V e lo p m

17、 e n t ， a n d e p it h e lia l ca lciu mca t e n in ( E - ca d h e r in ) w a sa nim p o r t a n tp r o t e inint h eE M T 11 1 T h ep r o lif e r a t io no f t u m o rce llsca nb eb e t t e rr e s p o n s e db yK i6 7 ，t h ein d e xo fK i6 7w a sh ig h ly co llr e la t e dw it ht h ed e g r e eo f

18、 m a lig n a n cy ，a sw e ll a st h ec印a b ilit yo fin v a s io n a n dm e t a s t a s isa n dp r o g n o s iso ft u m o r T h e r e f o r e ，ith a sb e e nw id e lyu s e dt o m e a s u r et h ep r o lif e r a t io nina V 撕e t yo ft 啪o rce lls 【1 2 - 14 1 T h ep u 叩o s eo ft h is s t u d yw a sa sf

19、o llo w s ，1 N o d a le x p r e s s io nle v e lw a sd e t e ct e dinn o n n a lco lo n m u co u sm e m b r a n e ，co lo na d e n o m aa n dco lo na d e n o ca r cin o m a 2 T h e r ew e r e d if f e r e n te X p r e s s io n so fN o d a lint h et h r e et is s u e so rn o t ，a n dt h er e la t io n

20、 s h ip s b e t W e e n d a la n dm e ircl妣a l p a m o lo g ica ls i鲥f ica n ce 3 W e s t e mB 1 0 t w a su s e dt od e t e ct t h e e x p r e s s io n o fN o d a l p r o t e in inn o n n a l c0 1 0 n m u co u sm e m b r a n ea n dco lo na d e n o ca r cin o m a M e t h o d 1 I m m u n o h is t o ch

21、 e m is t 巧( I H C ) E n v is io nm e t h o d As e a r cho ft h e s u 唱ica lp a t h o lo g yd a t a b a s e s w e r eco n d u ct e da tt h e D e p a r t m e n to fP a t h 0 1 0 9 yo ft h eL u z h o uM e d ica lC 0 1 le g eA 衔lia t e dH o s p it a l 仔o mJ a n u a 巧2 012t oS e p t e m b e r2 012 At o

22、t a ln u m b e ro f14 6co lo nt is s u e s w e r ein clu d e dint h iss t u d y ，in clu d in g2 3n o r I 】 1 a lco lo nm u co u sm e m b r a n e ( t u m o rd is t a lb o r d e r ) ，2 3co lo na d e n o m aa n d1O Oco lo na d e n o ca r cin o m a A ll p a t ie n t s w e r e d ia g n o s is e db y t w

23、o p a t h 0 1 0 9 is t s o fL u z h o uM e d ica l P a t h 0 1 0 9 y 5 C o lle ct e dp a t ie n t s r e le V a n tin f o m la t io n ，in clu d in ga g e ，g e n d e r ，D u k e ss t a g e ， d i能r e n t ia t io n ，T - s t a g ea n dN s t a g e ，V iaa d m is s io n ，m e d ica l，s u 玛ica l r e co r d s ，

24、 e x a m in a t io nr e p o r t sa n dt h e 皿s lice s ，a n dr e co r d e d A 1 lt h e s e14 6s lice sf o rim m u n o h is t o ch e m is t r y ，t h ea n t ib o d ie sin clu d in gN o d a l， E ca d h e r ina n dK i6 7 2 W 宅s t e mb lo t A 1 1o f16 仔e s ht is s u e sw e r ee x t r a ct e df 两mco lo na

25、d e n o ca r cin o m ap a t ie n t s ， in clu d in gt u m o ra n dn o m a l co lo nm u co u sm e m b r a n e ( t u m o rd is t a lb o r d e r ) ， w h ich 仔o mL u z h o uM e d ica lC o lle g eH o s p it a lI h ee x p r e s s io no f N o d a l p r o t e in sw e r ed e t e ct e db yW e s t e m B lo t R

26、 e s u lt 1 I H Cr e s u lt ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s io n so fN o d a linco lo na d e n o ca r cin o m a w e r es ig n if ica m lyh ig h e rt h a nt h ee x p r e s s io n sinn o r m a l m u co u sm e m b r a n e a n dco lo n a d e n o m a ， t h e p o s it iV e r a t e sw e r e4 3 5 inn

27、o m la lco lo n m u co u sm e m b r a n e ， 6 5 2 inco lo na d e n o m aa n d9 7 inco lo n a d e n o ca r cin o m a ，r e s p e ct iV e ly ( P O o o1 ) 2 I n1O Oca s e so fc0 1 0 na d e n o ca r cin o m a ，t h ee x p r e s s io n so fN o d a l w e r e p o s it iv e lyco r r e la t e dw it ht u m o rd

28、 if I f e r e n t ia t io n ( 尸O 3 6 2 ，尸 O 0 0 1 ) ，T - s t a g e ( 严O 3 5 0 ，尸 O 0 0 1 ) a n dD u l( e ss t a g e ( 严O 2 5 3 ，仁O 0 1 1 ) ，a sw e ll a st h e e X p r e s s io n so fk i6 7 ( 严O 2 51 ，仁O O12 )，w h ilet h e yw e r en e g a t iV e ly co r r e la t e dw it hE ca d h e r ine x p r e s s

29、io n( 严一O 2 6 4 ，仁O 0 0 8 ) 3 W e s t e mB lo tr e s u lt ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s io n so fN o d a lp r o t e ininco lo n 6 a d e n o ca r cin o m aw e r es ig n if ica n t lyh i曲e rt h a nt h en o r m a lm u co u sm e m b r a n e t is s u e s ，a n dt h e s er e s u lt sw e r eco n s i

30、s t e n tw it ht h eI H Cr e s u lt s C o n clu s io n 1 I nt h is s t lld y N o d a la r e1 0 w e x p r e s s e d int 1 1 en o r m a lco lo n m u co u sm e m b r a n et is s u ea n dco lo na d e n o m a s ，w h ile1 1 ig h lye x p r e s s e dm co lo na d e n o ca r cin o m a 2 N o d a la r er e la t

31、 e dt ot u m o rd i妇F e r e n t ia t io n ，T - s t a g ea n dD u k e ss t a g e ， in d ica t in g t h a tt h e e x p r e s s io n o fN o d a l m a yb eco n t r ib u t e dt o co lo n a d e n o ca r cin o m ace llsp r o lif e r a t io n ，in V a s io na n dm e t a s t a s is 3 U s in gs p e a n I la nc

32、o 玳la t io na n a ly s isw it hE ca d h e 打na n d 飚6 7s h o wt h a t N o d a lm a yh a V et h eca p a b iI i哆t op r o m o t ece ll p r o lif e r a t io n 甜ldm e t a s t a s iso f c0 1 0 na d e n o ca r cin o m a 4 D e t e ct io nN o d a l p r o t e ins u g g e s t sap o t e m ia l r o lef o rita san

33、 o V e lb io m a r k e r f o rclin ica l d ia g n o s is ，鲈a d in ga n ds t a g in g ，m a ya ls op r o V id e sar e f e r e n ce a b o u tt r e a t n le n to p t io n sa n dp r o g n o s isf o rclm ica l K e yW o r d s ：N o d a l；e m b 巧o n icm o 叩h o g e n ；co lo n ；n e o p la s m ； E ca d h e r in

34、 ； K i6 7 ；im m u n o h is t o ch e m is t 巧；W r e s t e mB lo t 7 j L - 一 刖吾 结肠腺癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，我国结肠腺癌的发病 率也呈逐年上升的趋势。由于本病的早期临床症状不明显，容易被病人忽 略，待到就诊时往往已经是中晚期，肿瘤已经广泛浸润甚至已经发生远处 转移，这不仅严重影响人类的健康，而且也是结肠腺癌患者死亡的主要原 因。但是，目前为止结肠腺癌的发展及转移机制尚未完全阐明，主要认为 是结肠粘膜从正常到腺瘤再到腺癌的转变过程中抑癌基因，粘附因子，血 管生长等因素联合失调有关，这是一个多阶段，多基因共同

35、参与的复杂过 程。因此，寻找与结肠腺癌发生，发展及预后相关的新的分子标志物，对 结肠腺癌的早期诊断，治疗方案制定及评估预后具有一定的临床意义。 N o d a l是转化生长因子( T u m o rG r o 刚hF a ct o r _ b e t a ，T G F B ) 超家族成 员之一，它是一个重要的胚胎形态发生素分子，在胚胎早期发育过程中诱 导中、内胚层的形成和左右体轴不对称的建立等一系列关键事件中发挥重 要的作用，而且N o d a l对维持人类胚胎干细胞( I u m a nE m b 巧o n icS t e m ce lls ，h E S C ) 的多向分化潜能也至关重要1

36、5 ，16 1 。 正常情况下N o d a l只存在或表达于早期胚胎组织，正常成熟组织中不 表达或者只有极低的表达，而近几年的研究显示N o d a l在多种人类恶性肿 瘤中重新表达 1 7 。19 1 ，这说明肿瘤的生物学行为具有类似胚胎组织的不成熟 性和多向分化能力，正是在这种成熟向幼稚的转化过程才诱导了N o d a l 的重新表达，而研究表明，重新表达的N o d a l也可能通过自分泌或者旁分 泌的方式影响肿瘤的发生和发展。与T G F p 家族其他成员一样，N o d a l 信号的传导也包括C r ip t o 1 ，A lk4 7 和S m a d 等蛋白的参与，这些分子能

37、够配合N o d a l在肿瘤形成发展过程中调节细胞增殖，加速细胞外基质的降 解，以及促进肿瘤血管生成，从而影响肿瘤的生长与侵袭转移【2 0 ，2 1 1 。 转移是恶性肿瘤重要特性之一，其转移的机制可能有上皮一间质转化 ( E p it h e lia lM e s e n ch y m a lT r a n s it io n ，E M T ) ，细胞黏附( C e llA d h e s io n ) 的改变和细胞发生迁移。研究表明，转移的发生与胚胎干细胞相关基因上 调有关，其中N o d a l就是促进早期浸润性事件发生的关键性胚胎因素，而 上皮钙连接素( E p it h e lia

38、 lca d h e r in s ，E ca d h e r in ) 是上皮一间质转化 ( e p it h e lia lm e s e n e h y m a lt r a n s it io n ，E M T ) 中非常重要的蛋白，它是一种钙 依赖型跨膜糖蛋白，是重要的细胞粘附分子，它能介导细胞间相互连接和 细胞与细胞外基质的粘附，从而发挥抑制肿瘤细胞侵袭和转移的能力 【2 2 ，2 3 1 。当肿瘤发生时，E ca d h e m 的结构或功能会出现异常，这种改变直 接影响它对细胞间或细胞与周围间质的粘附作用，从而使上皮细胞问连接 变得松散，变成具有间质细胞形态和特性的细胞，并获得

39、侵袭和迁移能力， 这种变化导致了肿瘤细胞的扩散和转移。 细胞增殖核抗原( 6 7 ) 是公认的细胞周期相关核蛋白，在除细胞间 期( G o 期) 以外的细胞周期中表达，且随着细胞周期的进程K i6 7 的表达 呈逐渐增高趋势。K i6 7 能较好的反应肿瘤细胞的增殖状态，其标记指数 与肿瘤的恶性程度、侵袭转移能力及预后高度相关，因此，它已被广泛地 应用于测定各种肿瘤细胞的增殖活性，如乳腺癌，胃癌，胰腺癌，宫颈癌 以及肺癌等 1 2 1 4 1 。 近年来有报道N o d a l在转移性黑色素瘤，胰腺癌，浸润性乳腺癌和子 宫内膜癌等7 ，9 ，1 9 明中瘤中存在表达，但在结肠腺癌组织中是否也存

40、在表达， 尚未见报道。本实验通过免疫组织化学和W - e s t e mB lo t 检测N o d a l在人结 肠腺癌中是否表达，及其表达与患者临床病理因素，与E ca d h e r in 和K i6 7 的表达是否相关进行分析，拟探讨N o d a l在结肠腺癌中表达的临床病理意 义。 材料与方法 1 实验材料与仪器 1 1病例纳入及新鲜组织收集 查阅泸州医学院附属医院病理科2 0 1 2 年1 月至2 0 1 2 年9 月的存档资 料，筛选出结肠腺癌1 0 0 例，结肠腺瘤2 3 例，正常结肠粘膜2 3 例( 均为 结肠腺癌根治术中肿瘤远端切缘) 。其中男性5 3 例，女性4 7 例

41、；年龄3 4 至8 5 岁，平均年龄5 9 3 7 土1 2 6 0 5 岁，肿瘤直径5 cm 者6 6 例， 5 cm 者 3 4 例；按照W H 0 诊断标准( 第四版) 患者均为原发性结肠腺癌，其中 高分化腺癌2 1 例，中分化腺癌4 3 例，低分化腺癌( 包括黏液腺癌和印戒 细胞癌) 3 6 例；按n 心压分期法，本实验中无T l期患者，T 2 期7 例，T 3 期7 2 例，T 4 期2 1 例，有淋巴结转移者( N l+ N 2 ) 3 6 例，无淋巴结转移者 ( N o ) 6 4 例。根据D u k e s 分期诊断，本实验中无结肠腺癌A 期患者，结 肠腺癌B 期，C 期和D

42、期分别为5 9 例，3 2 例和2 0 例。所有病例均经过 泸州医学院病理科两位高年资病理医生确诊，且均没有进行过放射治疗， 化学治疗，中医或激素治疗等。 从2 0 13 年4 月2 5 日开始，收集在泸州医学院附属医院已进行活检， 并确诊为结肠腺癌的新鲜结肠组织，主要为结肠腺癌根治术中切下的结肠 腺癌肿瘤组织和肿块远端切缘结肠组织，共1 6 例。 1 2实验试剂 1 2 1 免疫组织化学( I H C ) 主要试剂 名称来源 多聚赖氨酸( P o ly L L y s in e ) D A B 显色剂( 棕黄色) 0 0 1M 柠檬酸盐缓冲液( p H6 O ) E n s io n T M

43、 试剂盒 N o d a l E ca d h e r in K i6 7 苏木素染液 二甲苯 中性树胶 梯度酒精 武汉博士德生物工程有限公司 丹麦D A K O 公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 丹麦D A K 0 公司 美国A b c锄公司 丹麦D A K O 公司 丹麦D A K O 公司 泸州医学院病理科技术室提供 泸州医学院病理科技术室提供 泸州医学院病理科技术室提供 泸州医学院病理科技术室提供 1 2 2 蛋白免疫印迹( W e s t e mB lo t ) 主要试剂 名称来源 B C A 蛋白含量检测试剂盒 辣根酶标记山羊抗鼠I g G 1 5 MT r is H C L ，

44、p H 8 8 1 O MT r is H C L ，p H 6 8 脱脂奶粉 P D V F 膜( O 4 5 岬) N o d a l p - a ct in 彩色预染蛋白质分子量标准 辣根酶化学发光底物试剂盒 碧云天生物技术研究所 美国B io R a d 公司 索莱宝科技有限公司 索莱宝科技有限公司 伊利股份有限责任公司 I m m o b ilo n 密理博上海公司 美国A b c锄公司 美国B io w o r ldT e ch n o lo g y 公司 碧云天生物技术研究所 天根生化科技有限公司 1 3主要实验仪器 名称公司 E x ce ls io r T ME S 自动组织

45、脱水机 I 洲2 2 4 5 组织切片机 A X 一7 0 光学摄像系统 光学显微镜 恒温水浴箱 恒温电烤箱 美的空调 湿盒 电子天平 低温离心机 电泳仪、湿转转膜仪 8 0 冰箱 初级自动蒸馏水机 电热恒温鼓风干燥箱 7 9 1 磁力加热搅拌器 H Y 5 回旋式振荡器 高压蒸汽灭菌机 冰箱 D Y B 1 脱色摇床 凝胶成像分析系统 美国T h e m lo 公司 德国L e ica 日本0 ly m p u s 公司 日本0 ly I n p u s 公司 上海一恒科技有限公司 上海医疗器械七厂 中国美的公司 北京西城区医疗器械厂 北京赛多里斯仪器系列有限公司 珠海黑马医学器械有限公司

46、B io R a d ，北京六一器械厂，T a n o n 美国T h e r m o 公司 成都品成科技有限公司 上海齐欣科学仪器有限公司 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂 上海申安医疗器械厂 无锡松下冷机有限公司 江苏省兴化市分析仪器厂 美国B io I h d 公司 2 实验方法步骤 2 1 免疫组织化学染色( I H C ) 2 1 1标本处理 所有标本均用4 的中性甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋。挑选形态 学上典型的蜡块进行连续切片，切片厚3 5 岬，分别将切片裱于事先用 多聚赖氨酸处理过的载玻片上，6 0 烤箱烘烤备用。 2 1 2 免疫组织化学染色( I

47、H C ) E n s io n 两步法 I H C 采用标记非生物素系统两步法。第一抗名称，来源，工作浓度及 抗原修复方法见表1 ，第二抗为即用型非生物素免疫组化E n s io n T M 检测 试剂盒( D a k o ) 。步骤如下： 1 石蜡切片常规二甲苯脱蜡，1 0 m in 2 次；梯度酒精脱水，依次通过无 水乙醇I ，无水乙醇I I ，9 5 乙醇，8 0 乙醇，7 0 乙醇，5 0 宜乙醇， 分别1 0 m in ，蒸馏水温和冲洗，注意脱蜡要充分； 2 修复抗原：将切片浸入装有O 0 1M 枸橼酸盐缓冲液( p H6 O ) 或者 E D T A 的修复盒中，放入高压锅加热到

48、沸腾，再加热5m in 左右即可， 取出修复盒开盖自然冷却，T B S 洗5 m in 3 次； 3 封闭：将切片放入3 的H 2 0 2 中封闭1 0 m in ( 室温、避光) ，以阻断 内源性过氧化物酶，蒸馏水洗至无味，再用T B S 洗5 m in 3 次； 4 第一抗孵育：每张切片滴加约5 0 山第一抗，于湿盒3 7 孵育1 h ，注 意使组织充分与抗体接触，防止干片； 5 用T B S 洗5 m in 3 次； 6 第二抗孵育：每张切片滴加约5 0 p lE n v is io n 液，于湿盒3 7 孵育 3 0 m ln ： 7 用T B S 洗5 m in 3 次； 8 D A

49、 B 显色液显色：滴加1 2 滴D A B 显色液至切片上，光镜下控制显 色，适时终止反应； 9 自来水温和冲洗； 1 0 用苏木素复染切片3 5 m in ，水洗，盐酸酒精分化数秒，自来水反蓝 约1O m in ； 1 1 用常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 表1 抗体名称，来源，工作浓度及抗原修复方法 T a b 1A n t ib o d ie sn a m e ，s o u r ce ，t h eco n ce n t r a t io na n da n t ig e nr e p a ir in gm e t h o d s 2 1 3 免疫组织化学染色( I H C ) 阳性判定标准 1 N o d a l为细胞质阳性，胞浆可见棕黄色颗粒沉着。取