Siglec家族

Siglec 家族属于一次穿膜的Ⅰ型膜蛋白， 在结构上具有非常典型和保守的结构特征， 其穿膜区由 2 ～17 个胞外 Ig 结构域组成，N 端由一个结合唾液酸的V-set Ig 结构域和一定数目的 C2-set Ig 结构域组成。大多数 Siglecs 胞内段含有免疫受体酪氨酸活化基序 ( immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs) ，从而发挥免疫抑制功能; 少数Siglecs如 Siglec-14-16 和 Siglec-H 通过其穿膜区荷正电的精氨酸与 ITAMs 的转化子 DAP12 相结合发挥免疫调控作用。

早前关于Siglec的研究集中在CD33 表达于单核细胞， 中性粒细胞和髓系前体细胞。特异性靶向 CD33的单抗体药物 gemtuzumab ozogamicin 在 2002年被批准用于急性髓样白血病( AML) 临床治疗，目前临床中仍然不少CD33相关的ADC及肿瘤免疫疗法在开发。但是近年来研究表明， Siglecs 通过调控固有免疫和适应性免疫应答，在机体自身免疫性疾病、炎症反应和肿瘤中发挥重要调控作用， 有可能将成为肿瘤免疫治疗的新的方向。

Siglec-9

2018年，《Journal of Clinical Investigation》杂志介绍了一个全新的免疫检查点Siglec-9。该研究通过分析非小细胞肺癌肿瘤中Siglec的表达情况，结果显示Siglecs自然是在NK和髓细胞上大量表达，但同时也发现在肿瘤浸润的T细胞，包括CD4+和CD8+T细胞上的表达水平要显著的升高，相对于健康人外周血中的T细胞以及肿瘤病人正常组织中T细胞。这其中Siglec-9是最为突出的一个。

▲Siglec-9在肿瘤细胞及微环境中有大量表达

为了 Siglec-9体内的作用机制，首选在小鼠模型中以替代分子Siglec-E进行考察，结果显示小鼠同系移植瘤模型中Siglec-E的各种表征和人Siglec-9高度相似。包括SIGE+CD8+阳性细胞增加，和PD1等共表达等。敲除GNE后MC38和EMT6肿瘤生长被显著抑制，这些表明唾液酸化和肿瘤的生长具有直接影响。

▲敲除GNE后MC38和EMT6肿瘤生长被显著抑制

在Siglec-9转基因小鼠中，T细胞表面的Siglec-9可以结合鼠肿瘤细胞表面的唾液酸化配体，MC38肿瘤生长速度显著增加。这些结果都支持Siglec-9在T细胞表面发挥检查点作用介导肿瘤的免疫逃逸。专注NK细胞信号通路的Innate pharma目前正在开展该靶点的药物开发。2018年AACR展示了临床前结果，初步结果显示Siglec-9抗体可以增强NK细胞的杀伤活性。

▲Siglec-9转基因小鼠中肿瘤生长速度显著增加

Siglec-15

Siglec15则是继PD-1/L1后，作为陈列平教授“免疫正常化”理念提出后的又一重要的代表靶点。为了找到新的肿瘤免疫调控分子，研究者使用的高通量功能筛选系统(TCAA)，借助它可以在体外实验中鉴定调节T细胞活性的细胞表面分子。这一系统包含6500多个人类基因，编码人类基因组中90 %以上的跨膜蛋白。

经过多轮筛选，只有持续抑制或者增强GFP信号的基因才被选出用于后续的体内及体外实验分析。在这些候选基因中，有一些是已经报道的共刺激分子（B7-1,B7-2,CD200,CD70），凋亡相关分子（FASL,TRAIL,GZMB）或共抑制分子（KLRD-1, BTN3A3），这也证实了此TCAA体系的准确性。而这其中Siglec-15则表现出持续抑制T细胞活性，并且具有免疫正常化治疗的主要特征，因而被选择用以后续研究。

Siglec-15是唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族（Siglec family）中的一种基因，编码一段很短的胞外结合域（ECD）。蛋白质序列分析显示Siglec-15的ECD中包含一个免疫球蛋白可变区（IgV）和一个2型恒定区（IgC2），与B7基因家族有30%以上的相似性。以上数据表明，Siglec-15与B7基因家族关系密切，可能与B7家族成员一样，具有免疫调节功能。

▲Siglec-15的与B7家族具有高度同源性

小鼠全身敲除Siglec-15后，这些小鼠免疫系统正常也无其他疾病。通过流式细胞术检测，发现S15KO小鼠的抗原特异性T细胞反应性更强，结合增殖与凋亡流式结果，证实Siglec-15通过调节细胞生长而不是细胞凋亡来抑制抗原特异性T细胞反应。在巨噬细胞/髓系细胞上的Siglec-15条件性敲除鼠（LysM-Cre S15KO）上得到了一致的结果，并发现Siglec-15依赖IL-10发挥抑制功能。

▲Siglec-15的敲除有效增强T细胞的增殖

随后陈教授的实验室开发了Siglec-15的单克隆抗体α-S15，发现α-S15的确阻断Siglec-15对抗原特性T细胞的抑制作用。鼠源结肠癌细胞系MC38低表达Siglec-15，为研究高表达Siglec-15的人类肿瘤，在皮下移植瘤模型中引入骨髓巨噬细胞。在MC38细胞分别与不同来源的BMDMs细胞混合共培养后，通过皮下注射植入小鼠体内。结果显示，来源于野生型小鼠的BMDMs显著促进MC38肿瘤生长，而使用单克隆抗体α-S15后，这种促肿瘤的效应被消除。

为探索Siglec-15的抑制效应是否与B7-H1/PD-1重叠，将来源于野生型小鼠的BMDMs与敲除PD-1的T细胞共培养，发现α-S15依旧能促进T细胞增殖及分泌细胞因子。此外，无论有无PD-1抗体处理，α-S15均能促进人外周血T细胞产生细胞因子。这就提示，Siglec-15独立于B7-H1/PD-1发挥免疫抑制作用。在MC38细胞上过表达Siglec-15，皮下注射或静脉注射至小鼠体内，发现α-S15显著抑制肿瘤生长和转移。

▲α-S15抗体具有明显的抗肿瘤作用

陈教授的实验室通过通过两年多的时间，初步证实了Siglec-15是一种新型的免疫抑制分子，它可以成为肿瘤免疫治疗正常化策略的候选靶标。特别是Siglec-15免疫抑制不依赖于B7-H1/PD-1，这就为当前免疫治疗无响应，尤其是对anti-PD-1/PD-L1治疗不响应的患者提供了新的候选方案。目前，Nextcure的Siglec-15单克隆抗体（NC318）对人实体肿瘤影响的实验已经进入一期临床试验（NC03665285）。

Siglec-10

2019年7月31日，斯坦福大学医学院Irving Weissman教授团队，在Nature上发表的一篇研究论文发现了一个全新的“别吃我”信号，一种在癌细胞表面高度表达的名为CD24的蛋白，该蛋白也能向巨噬细胞发出“别吃我”的信号，通过与肿瘤相关巨噬细胞上高表达的抑制性受体Siglec-10结合，从而抑制巨噬细胞的吞噬作用。且该研究实验已经表明，在转移了人类癌症的小鼠中阻断这一信号可以使巨噬细胞细胞恢复吞噬作用，进而重新攻击癌症。

▲CD24在人类癌症中过表达，其受体Siglec-10在肿瘤相关巨噬细胞上表达

CD24，全称为cluster of differentiation 24，又称热稳定抗原，是一种高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇锚定表面蛋白，已知与先天免疫细胞上的Siglec-10相互作用，以抑制响应感染、败血症、肝损伤和慢性移植物抗宿主疾病的破坏性炎症反应。然而，也有研究显示，CD24表达于多种实体肿瘤，但该分子在调节肿瘤免疫反应中的作用尚未被证实。

▲CD24直接保护癌细胞不被巨噬细胞吞噬

这项新研究证实，肿瘤表达的CD24通过与表达在肿瘤相关巨噬细胞上的抑制性受体Siglec-10相关作用，促进了免疫逃逸。多种肿瘤过表达CD24，且肿瘤相关巨噬细胞上表达了高水平的Siglec-10。通过对CD24或Siglec-10进行基因消融或使用抗体阻断CD24-Siglec-10相互作用，研究中所检测的所有表达CD24的肿瘤中巨噬细胞的吞噬作用均显著增强。

▲CD24抗体治疗促进癌细胞的吞噬清除

总结来看，CD24是一种在多种癌症中高表达的抗吞噬信号，阻断CD24有望成为一种新型免疫疗法。同时CD24信号似乎常常以与CD47信号互补的方式发挥作用。有些癌症，如血癌，似乎对CD47信号阻断疗法非常敏感，但对CD24信号抑制剂却不敏感，而一些其它癌症，如卵巢癌，情况正好相反。这表明，CD24可能是一个主要的“别吃我”信号。

小结

Siglec的配体目前还未完全鉴定出来，但从名称来看可以猜想，应该是一系列唾液酸化结构的配体，同时从以上的这几个案例来看可能正是这些唾液酸化的配体分子以一种自体相关分子模式抑制自身免疫性反应。

肿瘤细胞表面的唾液酸化配体分子通过与Siglecs结合会诱导巨噬细胞分化为TAM表型，促进MDSC增殖，并抑制巨噬细胞及NK细胞介导的肿瘤杀伤功能，导致肿瘤细胞的免疫逃逸。随着更多Siglecs和肿瘤浸润的T细胞活性相关性被证实，Siglec作为下一代肿瘤免疫疗法已经不远了。

参考文献：

1.Self-associated molecular patterns mediate cancer immune evasion by engaging Siglecs on T cells

2.Siglec-15 as an immune suppressor and potential target for normalization cancer immunotherapy

3.CD24 signalling through macrophage Siglec-10 is a target for cancer immunotherapy

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