小分子蛋白跑Western blot(WB)时有什么需要注意的地方? | 您所在的位置:网站首页 › 电泳要跑到什么程度 › 小分子蛋白跑Western blot(WB)时有什么需要注意的地方? |
一般来说分子量越小的蛋白条带越易呈现出向四周弥散的趋势,甚至最终看不到条带,其原因是分子量越小的蛋白所能结合到的SDS也就越少,在电场作用下,蛋白向前迁移过程中会向四周弥散,最终呈现不出相应的蛋白条带。可以参考以下方法解决: (1) 一般20kd以下的蛋白,电泳选择15%以上的胶。 (2)增加浓缩胶比例,浓缩胶和分离胶为1:1,或者根据自身具体情况来调整,使蛋白样品在分离前充分聚集、压平,一定程度上有助于蛋白分离。 (3) 缩短电泳的距离,可以减少蛋白迁移过程的弥散程度,但需要确保目的蛋白和内参区分开。 (4)电泳过程中注意降温,温度升高会加快小蛋白分子的运动,增加弥散速度。 (5)转膜液不要加SDS,要加10-20%的甲醇;甲醇的作用有两方面:一是将小分子蛋白上的SDS洗脱,带的负电荷减少,减慢移动速度,能有效防止其穿透PVDF膜;二是可以帮助转到膜上的蛋白固定在膜上,使其不易脱落。 (6)转膜一定要选择0.22μm的PVDF膜,17kd以下的蛋白基本会穿透0.45μm的膜;当穿透严重时,可以用两张0.22μm膜叠加使用。 (7)还可以减少转膜时间,降低转膜的电压电流,200mA-250mA转15-30min差不多就可以了。 汉恒生物专注病毒包装十余年,同时还可以提供western blot和qPCR等检测验证服务,欢迎咨询了解! |
CopyRight 2018-2019 实验室设备网 版权所有 |