WB最常遇到的20个问题

Western Blot虽是实验室最常用的蛋白分析技术，但是由于它步骤繁琐、操作流程长、影响因素多，所以，导致我们在做实验时会遇到各式各样的问题。今天我们总结了一些WB实验中经常遇到的各种“奇葩”条带问题，并为你推荐了常用的解决方法，希望对大家有所帮助。

一、目标条带没有信号

原因分析解决方法

样品中可能含有蛋白酶，使蛋白样品分解成小分子。

添加蛋白酶抑制剂。

目标蛋白浓度过低（低于检测下线）。

力

加大上样量或提高目标蛋白浓度。

转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上，或者转膜时间过长导致样品转穿。

控制转膜时间并选择适合的转印膜。

一抗的特异性不佳，导致一抗无法识别目标蛋白。

选用高品质抗体。一抗反复使用后导致效价降低，尽管还能与目标蛋白连接，但连接蛋白的数量太一抗不宜反复使用。洗脱过渡导致与一抗相结合的目标蛋白被洗掉。洗脱时间的时间和频率应有效控制，一般建议3次10分钟。

二. 图片背景过高，难以分辨条带

原因分析

解决方法一抗浓度太高，导致抗体非特异性结合。降低一抗浓度。

洗膜的时间和次数不够，导致其他蛋白没有清洗干净

提高洗脱时间和频率。

封闭物用量不足。

提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜。封闭物使用不当。检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭。封闭时间不够。室温37度封闭1小时以上，4度封闭过夜。一抗稀释度不适宜。对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育的温度偏高。建议4℃结合过夜。

三、 膜上出现黑点和黑斑

原因分析解决方法

膜上其他部位与一 抗或二抗非特异性结合，配置的封闭液可能没有完全溶解，使不容颗粒附着在膜上从而导致发光时候膜上形成黑点。

配置封闭液后最好静止一下，封闭牛奶一定要纯，封闭结束之前要清洗三遍之后再加一抗。抗体与封闭试剂反应。使用前过滤封闭试剂。HRP偶联二 抗中有聚集体。过滤二抗试剂，去除聚集体。

四、出现非特异性条带

原因分析解决问题一抗非特异性与蛋白结合，此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好。更换一抗。目的蛋白有多个修饰位点，有些一抗还能结合其他蛋白的结合位点。更换一抗品种。蛋白样品降解，蛋白酶将目标蛋白分解成若千个蛋白，而这些蛋白同样可以被一抗识别。添加蛋白酶抑制剂。

五、条带中出现整条白色空斑

原因分析解决问题过高的蛋白上样量或一抗和二抗浓度过高都会促使底物过快的消耗，导致我们在做化学发光检测时，发光底物已经消耗殆尽而形成空斑。减少蛋白上样量、稀释一抗和二抗的浓度。

六、条带中出现白圈、气泡

原因分析解决方法转膜时候，膜与胶之间有气泡。 制作“三明治”时，注意赶走气泡。通常将电转液倒入一个盘子里，液体高度与第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇一些转膜液，把电泳胶用清水清洗后平铺在滤纸上，随后在确认滤纸与胶之间无气泡后，再往胶上浇一些电转液，之后用双手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜两侧中间，使膜成U型，再将U型底部接触到胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样可以减少气泡。上层滤纸同样用U型的放置方法，可以用玻璃棒贴实一下，然后盖上海绵垫。

七、过度转印

症结解决转移时间过长减少转印时间转移电场过强降低转印电压或电流

转移缓冲液未优化 

组装“三明治”之前，在转印缓冲液中平衡凝胶20分钟以降低凝胶中SDS浓度，从而避免小分子量蛋白的过度转移；将转印缓冲液中的甲醇浓度增加至 40%。

凝胶选择不恰当使用更高百分比的丙烯酰胺凝胶，当目标蛋白分子量小于 10 KD 时使用Tris/tricine凝胶。使用 0.2 µm 的印迹膜解决小蛋白转印过度的情况。

八、转印不足

症结解决

转移时间过短

如果使用湿转法，则需增加转移时间转移电场过弱增加转移电压或电流

转移缓冲液未优化

在转移缓冲液中加入0.01-0.05%的SDS；将转移缓冲液中的甲醇浓度减少至 5% 或更少

凝胶选择不恰当

使用更低百分比的丙烯酰胺凝胶

九、转印不均匀

症结解决

印迹膜部分变干或水化不均匀

确保整张印迹膜均匀浸入转移缓冲液中并充分平衡；PVDF 膜在放入缓冲液之前需要用 100% 的甲醇预先浸湿平衡

硬件问题

检查湿转装置的线路连接；确保金属平板清洁，无物理损伤；即便是金属平板发生轻微弯曲也可以极大地改变半干转印系统的电场强度

十、检测信号弱或无信号

症结解决抗体问题：低活性或低浓度，低亲和力的一抗，错配的一抗和二抗提高抗体浓度；抗体可能已经丧失活性;进行斑点杂交以确定其活性和最佳浓度；测试不同一抗和/或一抗/二抗组合；同时使用阳性对照和阴性对照

抗原提呈不足

增加凝胶中每个样品的总蛋白上样量；检查样品的完整性；确保蛋白未降解

抗原被封闭缓冲液封闭

尝试不同的封闭液 (比如，在检测磷蛋白时避免使用牛奶)；优化封闭液浓度，建议使用浓度为 3–5% 的牛血清白蛋白或脱脂奶粉化学发光底物性能不佳增加底物孵育时间；准备少量工作液以确定底物是否已经丧失活性。暗室内，在底物工作液中加入少量HPR偶联物则应该会出现蓝光。如果没有的话，必定是底物或 HRP 偶联物已丧失活性；确保底物试剂盒中的两个瓶子之间没有发生交叉污染。两种试剂之间如果发生交叉污染，则会引起试剂活性下降；叠氮化物是 HRP 的抑制剂；不要在二抗缓冲液中使用叠氮化物

印迹膜抗体剥离和再杂交

优化抗体剥离条件；仅在必要时进行再杂交检测；避免对同一印迹膜进行多次重复再杂交

蛋白质未转移

优化目标蛋白转移效率

十一、非特异条带

症结解决

抗体浓度过高

降低抗体浓度

非特异位点封闭不足

提高封闭剂浓度，如从 5% 提高到 7%；增加封闭时间和/或温度；向封闭缓冲溶液中加入 0.05% 的 Tween 20；抗体稀释液采用相同的封闭缓冲液（加入0.05%的Tween-20)

SDS使抗体和固定的蛋白条带发生非特异性结合

转移后洗涤印迹膜；在免疫检测过程中不要使用SDS

抗体质量

尝试使用不同抗体

非特异性条带是指除目标蛋白以外的条带，杂带较多影响结果判断，且结果不可靠。下面我们结合实际案例对其可能原因进行分析，并找出相对应的解决方法，见表。

表 非特异性条带多可能原因和解决方法

可能原因

解决方法

抗体稀释度问题，如图4-15。

降低上样量；提高一抗稀释度。

抗体未纯化

使用单克隆或亲和层析纯化后的抗体，减少非

特异条带

转膜强度太强，导致杂带太强，如图4-16。

降低转膜强度（时间和电流），使目标蛋白上

方的蛋白少转移到膜上。

抗体与蛋白非特异性结合，如图4-17。

更换抗体

封闭不完全

增加封闭液中蛋白浓度

细胞传代次数过多，导致其蛋白表达模式分化

使用原代或者传代少的细胞株，和现在的细胞

株一起做参照

新蛋白或同族蛋白分享同种表位的不同剪接方式

查其文献报导，或BLAST查询，使用说明书报

导的细胞株或组织

十二、条带拖尾

原因分析解决方法这种情况很容易出现，因为导致条带拖尾的原因很多，可能性较大的是一抗浓度太高，作用时间太长或。根据情况调整蛋白量，同时降低一抗的浓度，缩短一抗的时间。

十三、条带变形

原因分析解决问题胶体中存在气泡，或不溶性杂质，胶不均不平整。配胶时用的小烧杯，水，SDS，tris等等干净无杂质。贴边角加入液体，凝固时避免大幅度动作触碰。

十四、条带呈哑铃装

原因分析解决方法出现哑铃装条带的问题，最大的可能性就是胶没有配置好，胶凝固后不均一。另外还有一种可能就是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉淀在孔的中间，蛋白被挤到两边。把胶配好，不合格的胶坚决不能用。

十五、最边缘条带弯曲、皱眉条带

原因分析解决方法电泳电流不均一换电泳槽，或者不使用两边的孔。

与微笑状条带相反，条带成现“︵”皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。可通过调整装置来避免该问题。如图。

十六、背景非均一性、印迹背景有污迹、印记背景有斑点

原因分析解决方法膜可能干过。在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干掉，确保蛋白面不要被风干很长时间，一定要用不漏水的封闭盒并盖上盖子，防止过夜16个小时液体流失。

症结解决

部分印迹膜变干

确保印迹膜保持湿润；确保印迹膜一直覆盖有足够液体以防止其变干

洗涤缓冲液与某些印迹区域接触不足

增加洗涤缓冲液用量；避免过多印迹堆叠在一个孵育容器内洗涤缓冲液与某些印迹区域接触不足使用干净的或新的转移“三明治”

印迹膜污染

请勿用手直接接触印迹膜。一直配戴清洁手套或使用医用镊子；确保电泳设备、转移设备和孵育盘清洁，远离外部污染源

症结解决

凝胶碎片粘附于印迹膜之上

将印迹膜表面残留的丙烯酰胺凝胶碎片移除

成块的封闭剂粘附于印迹膜之上

确保封闭剂在使用前完全溶解；向封闭缓冲溶液中加入 0.1% 的 Tween-20

抗体聚合

使用 0.2 µm 的过滤器过滤抗体缓冲液；使用新鲜抗体；向抗体缓冲溶液中加入 0.1% 的 Tween-20

缓冲液污染

使用新的缓冲液；使用 0.2 µm 的过滤器过滤缓冲液

十七、条带呈“微笑”或“倒微笑"”状

原因分析解决问题条带呈“微笑U”状，凝胶冷却不均一，电泳槽老化。更换电泳槽。条带呈“倒微笑∩”装，凝胶左右两头没有凝固好。重新制胶。

电泳速度过快，可通过减少电压等减慢电泳速度。二是电泳温度过高，使得胶变形，可在冷室或者冰浴中进行电泳或者改变电泳pH。

十八、其他问题

原因分析解决方法蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。

十九、条带粘连

条带粘连是不同孔目标条带连在一起，中间无间隔，如图所示。出现该现象的原因可能是上样量太多，或者是制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔。可通过减少上样量和提高配胶质量来避免该问题。其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）

二十、分子条带大小不对

分子条带大小，即条带位置异常，主要包括三种情况。第一种是出现高于目标蛋白较多的条带，如图，该现象可能是由于蛋白未充分变性，导致蛋白形成二聚体或者多聚体。为避免该现象，可在实验之前加入新配的DTT，重新加热使得蛋白充分变性或者直接使用新的蛋白样本。第二种是出现略高于目标蛋白的条带，如图4-11，该现象可能是由于蛋白被修饰，如糖基化/磷酸化等，可导致分子量增加。解决方法是尝试使用酶去除可能的蛋白修饰。第三种是出现比目标蛋白略低的条带，如图4-12，该现象可能是由于蛋白翻译后剪切或者降解。在样品准备时候要在冰上操作或者是加入更过蛋白酶抑制剂，以防止蛋白降解。

以上是我们对WB条带出现各种状况及解决方法的一个总结，希望可以对大家有所帮助。如果各种原因都试变了，还是做不好WB实验怎么办？

跑出漂亮条带的秘诀，你学会了吗？