好氧甲烷氧化菌及其工程应用进展

好氧甲烷氧化菌(aerobic methane-oxidizing bacteria, MOB) 是能以甲烷为唯一碳源和能源的微生物。它在环境中广泛存在，能将厌氧环境产生的甲烷氧化，避免其逃逸到大气，对全球甲烷消除的贡献率高达10%–20%[1]。由于对全球变暖问题的重视，好氧甲烷氧化菌也越来越受到关注。同时，由于好氧甲烷氧化菌特有的甲烷代谢途径和功能酶，可以利用它将甲烷合成高价值生物产品，从而使其具有商业价值，相关甲烷合成化合物的工程应用也成为热点，在聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoate, PHA) 和单细胞蛋白(single cell protein, SCP)生产中生产规模以吨计，可提高勘探钻井成功率达83%[2]。

随着人们对好氧甲烷氧化菌种群特征和代谢过程研究的深入，对好氧甲烷氧化菌的实际应用也越来越广泛。本文针对已经实现工程应用的几个领域，介绍了好氧甲烷氧化菌应用技术的发展现状。文中还分析了好氧甲烷氧化菌规模化培养中存在的问题，以及在代谢机制和种群关系研究等方面存在的不足，以促进好氧甲烷氧化菌生物技术的应用推广。

甲烷氧化菌的驯化培养是对其进行生物学特性研究和微生物应用的前提。甲烷氧化菌的首次被分离成功可追溯到1906年，并提出了简单的甲烷氧化菌培养方法。Meruvu等[1]总结了现有的甲烷营养生长培养基的组成，及其相应的甲烷氧化菌来源和目标甲烷营养菌，不同研究中采用的实验室好氧甲烷氧化菌培养方法和条件见表 1[3-12]。

不同甲烷氧化菌的生长速度不同，许多甲烷氧化菌生长缓慢，包括一些在极端环境分离出的种类，如从温热泉环境中分离出来的甲基暖菌(Methylocaldum marinum)、甲基细胞菌(Methylocella silvestris)，在琼脂平板上出现菌落可能需要2–4周[13]。另外有些生长速率高的菌种较适于生物合成等工程应用而被广泛关注，如甲基球菌(Methylococcus capsulatus) Bath和甲基弯曲菌(Methylosinus trichosporium) OB3b，生长速率可以达到0.2 h–1，细胞密度为1–5 g干重/L。而甲基单胞菌(Methylomonas methanica) 和甲基微菌(Methylomicrobium alcaliphilum) 的表观生长率约为0.4 h–1[14]。

由于受到甲烷代谢效率和气液相传质限制的影响，直接以甲烷作为碳源进行甲烷氧化菌的培养时，甲烷氧化菌的生长速率有时达不到工程应用的要求。有些菌种耐受甲醇等有机物，或者筛选、训练出耐甲醇的菌种，可以利用有机碳源高效培养目标甲烷氧化菌，满足生物合成的需要。

我们在对矿化垃圾中甲烷氧化菌的研究中发现有机碳源对甲烷氧化菌生长和甲烷利用的影响是复杂的。对从矿化垃圾中分离出来的菌株甲基孢囊菌(Methylocystis rosea) JTA1进行纯培养时，培养基中加入有机碳源可以促进其生长，增加细胞密度[15]。研究还通过向矿化垃圾中喷洒渗滤液，研究了有机质对甲烷氧化的影响。结果表明，渗滤液中的化学需氧量(chemical oxygen demand, COD) 增加对促进矿化垃圾的甲烷氧化有利，能提高矿化垃圾的最大甲烷氧化率。但如果COD过高会出现有机质氧化耗氧抑制甲烷氧化的现象，导致矿化垃圾甲烷氧化启动延迟。表现为体系的氧气消耗和二氧化碳产生量高，但甲烷氧化率低[16]。

很多研究针对甲烷氧化混合菌群培养条件的优化，因为甲烷氧化菌的应用多处在动态的外部环境下，甲烷氧化的混合菌群培养比纯菌培养表现更好。Syed等[17]观察到，使用纯培养物的生物滤池随着pH下降对甲烷氧化能力明显减弱，特别是当初始接种菌源不包含嗜酸属时。而当pH降至3.72时，甲烷营养菌群的甲烷氧化速率仍可达727 g CH4/(m3·d)。Melse等[18]的研究也表明混菌甲烷氧化性能总体优于纯菌，来自活性污泥和堆肥的混合培养物在甲烷氧化中的性能是甲烷单孢菌和甲基囊藻菌株纯培养物的3–5倍。

很多研究实现了甲烷营养菌的大规模培养，多采用混合培养，通过不同的运行方式将菌液用于甲烷氧化实际应用中(表 2)。

在混合菌的实际应用中，如何维持混合菌群的稳定性，保证持续的甲烷氧化率是很重要的。我们在利用矿化垃圾培养甲烷氧化菌的研究中发现，一次接种培养的混合菌群再传代培养时效果不理想，微生物对数生长期出现延迟，且只有在接种量较大时，才与直接接种培养获得的甲烷氧化率接近，而多次传代则甲烷氧化率无法维持[15]。Cantera等通过对反应器定期更换培养液来冲洗有毒化合物，保持运行稳定[19]。同时发现反应器运行初期混合菌中甲烷氧化菌为优势种群(M. alcaliphilum和噬甲基菌Methylophaga sp.共占60%左右)，但反应器的甲烷转化率稳定后，种群结构发生变化，M. alcaliphilum在细菌中的占比降到15%以下。

甲烷氧化菌混合菌群的获得多基于种源直接培养，因缺乏对甲烷氧化菌种群间作用的生物化学机制及其调控方法的研究，难以实现高效稳定菌群的人工构建，对稳定菌群特征的描述更少。对混合培养的代谢过程和种群关系方面的研究有利于维持混合菌群的稳定。

现有甲烷氧化菌培养过程的强化主要通过添加辅助因子实现，添加物可分为2类：甲烷氧化菌代谢营养需要的代谢型添加物和增强甲烷气液传质效率的传质型添加物。

代谢型添加物都属于简单化合物，本身就存在于菌种生境中或培养体系中。二氧化碳(CO2) 浓度对部分甲烷氧化菌有影响，严陈等[27]发现CO2浓度升高能促进水稻根际甲烷氧化细菌的丰度，包括疣微菌和变形菌门的部分甲烷氧化菌(TypeⅠ型的M. capsulatus、M. marinum，Type Ⅱ型的Methyloferula stellata、Methylocella silvestris、Methylocapsa acidiphila)。这些甲烷氧化菌可以通过卡尔文(Calvin-Benson-Bassham, CBB) 循环固定CO2作碳源。除了CO2外，氧气、氮气和氢气等补充气体也可以刺激部分甲烷营养生物的代谢[28-29]。某些金属离子也对菌体的生长有促进作用。由于铜离子能控制颗粒性甲烷单加氧酶(particulate methane monooxygenase, pMMO) 与可溶性甲烷单加氧酶(soluble methane monooxygenase, sMMO) 的差异化表达，培养时需添加铜离子以确保菌体良好地生长。Semrau等[30]发现，能进行甲烷(methane, CH4) 彻底氧化的M. album BG8 (Ⅰ型，只能表达pMMO) 和M. trichosporium OB3b (Ⅱ型，能够同时表达sMMO和pMMO)，Cu的加入会促进其生长。有研究发现，二价铁存在于sMMO中关键位置，以乙二胺四乙酸铁钠(ethylenediaminetetraacetic acid ferric sodium salt, NaFeEDTA) 和钼酸盐形式存在的二价铁也经常被添加，用于富集固氮甲烷氧化菌。添加氮源增强代谢的选择有硝氮和铵氮，AlSayed等[31]发现向矿物盐培养基(mineral salts medium, MSM) 中加入硝酸盐浓度到40 mmol时，菌体生长速率和甲烷吸收速率分别增加了14%和25%。氨盐可以代替硝酸盐补充无机氮源，但通常以较低的浓度添加，因为氨是甲烷单加氧酶(methane monooxygenase, MMO) 的竞争性抑制剂。

传质型添加物包括石蜡油和非离子表面活性剂等。Han等[32]在硝酸盐矿物盐(nitrate mineral salt, NMS) 培养基中添加5% (V/V) 的石蜡油后，增强了甲烷的传质并提高了细胞密度，M. trichosporium OB3b的细胞密度达到14 g/L (干重)，在培养240 h后约是对照的7倍。Avalos等[33]在生物滴滤池中添加非离子表面活性剂Brij 35后，甲烷转化率比不添加表面活性剂的生物滴滤池提高了1倍。

此外，Veraart等[34]的研究结果首次揭示了非甲烷氧化异养菌-甲烷氧化菌相互作用中产生的挥发性有机化合物(volatile organic compounds, VOCs) 的促生长作用，这表明混菌产生的VOCs可作为新型培养强化添加物。

好氧甲烷氧化菌为革兰氏阴性菌，在自然界中分布广泛，仍有许多菌种未被培养。在已分离的好氧甲烷氧化菌中，按系统发育可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3种类型，分别属于生物分类意义上的变形菌门(Proteobacteria) γ亚型、α亚型和疣状菌门(Verrucomicrobia)。甲烷氧化菌通过MMO将底物氧化为甲醇，MMO分为颗粒性(particulate) 和可溶性(soluble) 两类甲烷单加氧酶。Ⅰ型好氧甲烷氧化菌主要通过pMMO酶氧化有机物，pMMO为含多基因簇的单一酶，故Ⅰ型菌作用底物多为低碳烃，生长较快，在低甲烷浓度环境中的适应性强，更适合甲烷减排和油气勘探领域，但环境不利于其生长时死亡率高。Ⅱ型好氧甲烷氧化菌通过sMMO完成底物氧化，sMMO途径需要多酶配合，故Ⅱ型菌底物范围广，多酶配合带来的复杂氧化系统同时使其生物质应用潜力大，环境变化抵抗力更强，适用于有机物污染去除和微生物合成领域。Ⅲ型好氧甲烷氧化菌多在极端环境下被分离，目前其代谢途径对工业应用的影响仍缺乏系统理解。

MOB对甲烷氧化过程如图 1所示，首先通过MMO将甲烷氧化为甲醇，再通过依赖周质吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine, PQQ) 的甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase, MDH) 将甲醇转化为甲醛，部分甲醛通过甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase, FADH) 氧化成甲酸，再通过依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD) 的甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, FDH) 转化为CO2，CO2中部分被释放排出胞体，另一部分被CBB循环固定以提供必要的碳。甲醛的另一部分中，Ⅰ型MOB通过磷酸核酮糖(ribulose monophosphate, RuMP) 途径固定碳，Ⅱ型菌通过四氢甲蝶呤-四氢叶酸(tetrahydromethanopterin-tetrahydrofolate, H4MPT-H4F) 进入丝氨酸途径产生生物质。

不同的MOB种类在甲烷氧化过程中会有不同的代谢过程和代谢产物，利用这种特性可以生产各种不同的目标化合物。MOB制甲醇的研究发现，甲烷氧化成甲醇需要甲酸氧化成CO2过程中产生的NAD+H+作还原当量，故Ⅰ型MOB在生物制甲醇应用中效率更高，而为提供Ⅰ型MOB生长所需，部分甲醛经RuMP途径后被转化为丙酮酸(PYR)，然后通过不完全的柠檬酸循环(citric acid cycle, TCA) 转化为生物质。相反，Ⅱ型MOB在生产生物聚合物(PHB/PHA，其中PHB为聚羟基丁酸酯，polyhydroxybutyrate) 方面有优势。在将甲烷代谢为甲醛后，Ⅱ型MOB会将部分甲醛通过H4MPT途径转化为甲酸，其中部分甲酸通过FDH氧化为CO2，另一部分经H4F途径进入丝氨酸循环，随后，Ⅱ型甲烷氧化菌分别在营养充足或营养不足的条件下进行TCA或PHA/PHB循环，并产生CO2。因此，不同种群的MOB可用于不同化合物的生产流程。

生活垃圾填埋场甲烷排放量占全球甲烷排放总量的6%–12%[35]，控制和减少填埋场的甲烷排放量，对减少全球温室气体排放有重要意义。填埋场覆土中的好氧甲烷氧化对甲烷排放具有调控作用，特别是在处理填埋场封场前和产气高峰后的低浓度甲烷有优势。很多研究基于填埋场覆土层的甲烷氧化速率(methane oxidation rare, MOR) 和影响因素，发展出多种强化甲烷生物氧化处理技术，包括生物覆盖层、生物窗口和生物过滤器等。

(1) 填埋场生物覆盖层

在没有填埋气收集系统的情况下，填埋场的甲烷减排完全依靠填埋场覆盖土壤的甲烷氧化过程。但由于填埋场覆盖土层不能保证甲烷氧化的最优条件，甲烷氧化率较低且变化范围也较大。Liptay等[36]使用稳定同位素测定方法，得到填埋场覆盖土的甲烷氧化率年均值最高约为10%。Barlaz等[37]测得用粘土做覆盖层时甲烷氧化率约为21%。Chanton等[38]通过对不同覆盖土壤类型及各种规模填埋场的调查发现，甲烷穿越覆盖土层时氧化率为22%–55%，平均为36%。

生物覆盖层是通过改进垃圾覆盖层设计，以优化甲烷氧化菌生长条件、增强填埋场甲烷氧化的技术。它包括一个促进甲烷氧化的顶层和下部的气体分布层(gas distribution layer，GDL)。GDL使用有一定强度和空隙率的沙砾建成，以利于在整个区域内均匀分布填埋气以实现有效地氧化。生物覆盖层的顶部甲烷氧化层主要由富含有机物的材料组成，例如堆肥[39-40]、污水厂污泥[40]、改性矿化垃圾[16]、泥炭[41]等，这些材料可以单独使用，也可以作为土壤的改良剂，能有效促进甲烷营养细菌的生长。Pawlowska等[42]将污水污泥添加到用沸石改良的复合材料中，检测到甲烷营养菌的活性增加了接近一倍。Tanthachoon等[43]通过对堆肥覆盖层施用渗滤液促进甲烷营养活性并增加了甲烷氧化率。通过填埋场现场实验，Yang等[44]发现使用矿化垃圾或生物碳改良土壤的生物覆盖层中甲烷氧化率平均值分别为61.5%、56.1%。

与传统覆盖层相比，生物覆盖层的甲烷氧化率有不同程度的提升，甚至在现场环境甲烷氧化率也能接近100%。Lee等[45]对12.5 m3 (2.5 mW× 5.0 mL×1.0 mH) 的生物覆盖层进行240 d的监测后发现，冬季的甲烷去除率为35%–43%，而夏末的甲烷去除率最高，达到了96%。Pecorini等[25]使用25 m2生物覆盖层，得到的最大甲烷去除率达到了98%，平均氧化率约为75%。Scheutz等[46]测得的生物覆盖层的甲烷氧化潜力为300 g CH4/(m2·d)，甲烷氧化效率达到81%–100%。Olivier等[47]对覆盖面积分别为400、256、256 m3的3个垃圾填埋场甲烷进行4年监测，在此期间甲烷量减少了50%–100%。

(2) 生物过滤器

传统的填埋场土壤覆盖以及改进的生物覆盖均是对填埋场表面进行无差别全覆盖以实现甲烷减排。而生物过滤器(biofilters) 将工程化的生物系统安置在填埋场局部的小范围区域中，填埋气(landfill gas, LFG) 通过主动或被动气体导排系统导入后端的甲烷氧化层被氧化。与覆盖层相比，生物过滤器通过气体收集系统或抽气泵等引导LFG流向，能够在保证甲烷氧化率的前提下减少安装面积，降低实施和监控成本。当填埋场没有气体收集系统时，或者在填埋场中观察到的点源排放处可以采用生物窗口(biowindows) 的运行方式。即在填埋场覆盖层的密封层中开口并嵌入甲烷氧化层，甲烷氧化层与低渗透性覆盖物(如合成覆盖物、压实粘土) 整合在一起，LFG通过渗透扩散自行进入生物窗口中的氧化层。

生物过滤器比生物覆盖层有更高的甲烷氧化效率，生物过滤器的甲烷氧化效果见表 3。氧气浓度的降低和甲烷负荷的增高都会造成生物过滤器的甲烷氧化率下降，因此过滤器表面氧化率高于底部[48-49]。根据Scheutz等[50]的研究，为保持生物过滤器的甲烷氧化率，氧气浓度不得低于1%。Gebert等[51]认为氧气浓度在3%–20%时甲烷氧化速率将达到最大。生物过滤器的甲烷氧化效果会随甲烷负荷的增高而下降[49]。在Pecorini等[48]的研究中，当CH4负荷为6.5 g CH4/(m2·h)时，氧化率为80%;当负荷为9.3 g CH4/(m2·h)，氧化率为70%。不过，当LFG中甲烷的浓度降低时，生物过滤器可以承受的甲烷负荷也会相应提高。Turgeon等在甲烷浓度3%–18%，填埋气负荷240 m3/h的条件下，进行了中试规模的生物过滤器(0.95 m×1 m×1 m) 研究，通过83 d的运行数据得知最大氧化速率为66 g CH4/(m3·h)[52]。

考虑到CH4在水中的溶解度较低，为获得较高的甲烷氧化率，生物过滤器的体积要满足一定要求，空床停留时间(empty-bed residence time, EBRT) 一般要大于甲烷等气体在气-液介质中转移所需要的时间，使用无机填料时EBRT至少4 min，而有机填料则需更高(相关研究中，EBRT为6.5 min[56]、50 min[57]、82.8 min[58]，差异很大)。Nikiema等[22]在对生物滤池研究的基础上，提出的容积负荷限值对生物过滤器设计有参考价值，在甲烷浓度从0.13%–1.20%时，甲烷的最大容积负荷约为0.075 m3/(m3·h)。为减小生物过滤器的体积，Eldon等[59]提出通过废气再循环的方式提高氧化效果。已有研究中，生物过滤器的体积一般不超过30 m3，58 m3生物过滤器去除封场填埋场甲烷是最大规模的实验。对大规模的现场实验，Streese等将通过小试、中试生物过滤器装置算出的动力学参数代入虚构的370 m3生物过滤器时，对2.5%的填埋气甲烷氧化率达90%[55]。

甲烷生物氧化用于煤矿甲烷治理时主要针对低浓度甲烷。煤矿64%的温室气体排放[60]是由通风气甲烷排放引起的，从作业面排出的煤矿通风气甲烷浓度低于1%。

采用生物技术处理低浓度甲烷通常是将高密度甲烷氧化菌菌液喷涂或灌注于煤层表面，或者将煤矿通风气(ventilation air methane, VAM) 通入生物过滤器处理。由于反应器规模、微生物菌液种类、填料类型、气体停留时间等的差异，已有研究得到甲烷去除率差别较大，对0.25%–1.00% VAM去除率在19.7%–90.0%范围内(0.25%–1.00%的VAM，甲烷氧化率最高90%[61]; 0.70%–0.75%的VAM，甲烷氧化率为41%[62]; 1%的VAM，甲烷氧化率为19.7%[63])。

在利用菌剂法治理煤矿甲烷的研究中，纯菌、混菌都具有甲烷减排效果，钻孔注入法和表面停留法能分别针对煤层和巷道中的甲烷进行处理。生物过滤器治理VAM中由甲烷氧化菌和其他细菌组成的混菌起关键作用，在混菌中已发现被用于VAM减排的MOB种类包括甲基单胞菌(Methylomonas fodinarum) ACM 3268[61]、甲基孢囊菌(Methylocystis parvus)[62]、甲基弯曲菌(Methylosinus sporium)[63]，均属于变形菌门(Proteobacteria)。此外，实际应用中多为甲烷氧化菌及其与其他微生物的混合菌群，如甲烷氧化菌混合菌群(mixed methanotrophic consortia, MMC)[64-65]、MMC与微藻混合菌群[66]、MOB-真菌混合菌群[67]，对应的甲烷氧化效果为110 μg CH4/(g soil·h)、589 mg CH4/(g biomass·d)、甲烷氧化率为90%。

在生物过滤器的运行中，填料的特性对VAM甲烷氧化率影响显著，其粗糙度、孔隙率、亲水性、电荷和化学组成会影响菌的附着。Limbri等以煤为填料构建连续式生物过滤器，在甲烷负荷139 g/(m3·h) 时，对1%甲烷浓度的VAM，MOR达27.2 g CH4/(m3·h)，去除率为19.7%[63]。Sun等[10]用粉煤灰陶粒作填料连续消除1% CH4，反应器(高400 mm，直径40 mm)，使用填埋场富集培养后的菌液，气体流量为0.9 L/h，平均氧化速度为4.628 g/(m3·h)。

空床停留时间是生物过滤器运行的重要参数，EBRT延长会增加甲烷氧化率。Sly用单一菌株处理甲烷浓度为0.25%–1.00%的空气时，停留时间为15 min时，甲烷氧化率超过70%，在20 min时去除了90%[61]。但是EBRT增大会导致VAM气体处理量小，增大反应器体积可以同时增加停留时间和气体处理量却会降低甲烷氧化速率。Nikiema等在18 L甲烷生物过滤实验研究中，用无机填料时，EBTR约为260 s，氧化率仅为41%，MOR为29.2 g/(m3·h)[62]。Plessis等在体积为33 L的生物过滤器中处理0.5%甲烷浓度VAM (V/V)，当生物滤池的EBRT超过30 min时，甲烷去除效率超过70%[57]。

虽然热氧化、催化氧化和低浓度甲烷富集技术是煤矿瓦斯气研究的主要方向，但生物法在废弃煤矿超低浓度甲烷(0.1%) 氧化方面投资成本低、灵活性好的优势不可忽略。现有研究初步表明了EBRT对甲烷氧化率的影响，同时证明了生物法治理VAM的可行性。实际应用还需进一步研究，如生物过滤法的生物稳定性、大气流量下氧化效率的维持、填料的筛选、营养物供应调节等。

填埋场、煤矿井中释放的低浓度甲烷不适合进行能源回收，可以利用甲烷氧化菌将其氧化生成二氧化碳而消除，但是这种处理方式不产生收益。现有的好氧甲烷氧化菌生物合成研究有助于将填埋气、煤矿瓦斯及沼气中的甲烷转化为高附加值的生物产品，如生物聚合物、胞外多糖，从而将减少CH4排放变为可持续而且有收益的过程。

好氧甲烷氧化菌可将甲烷转化为有价值的生物产品，其中研究最深入的甲烷来源产品包括甲醇、PHA和SCP。尽管MOB有巨大的产甲醇潜力，但目前要实现生物法甲烷制甲醇的工业应用，还存在一些问题[68]。利用MOB生产PHA相关研究已经进入了中小规模阶段，而生物法制SCP则已经实现大规模生产。

甲醇是一种重要的化学前体，可以用作化学原料、燃料或废水处理中的脱氮过程。与目前工业甲醇生产的化学催化过程相比，在MMO的催化下甲烷转化为甲醇一步就可以完成，反应条件温和，对环境友好。但是甲醇是甲烷氧化菌的中间代谢产物，正常情况下甲烷氧化菌会通过MDH将甲醇转化为甲醛，再进一步催化氧化至生成最终产物二氧化碳。若要实现甲醇的生物合成，需要抑制MDH，防止甲醇转化为甲醛[69]。

由于不同的甲烷氧化菌的甲醇脱氢酶存在差异，抑制的方法也不同。大部分生物合成甲醇的研究涉及的甲烷氧化菌属于alpha和gamma Proteobacteria，含有MxaFI型的MDH[70-72]，为钙依赖型，常用的抑制剂有MgCl2和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)。这类抑制剂同时会减少ATP的产生量从而降低产品产量。有研究通过添加甲酸盐作为额外的电子供体的方法减小MDH抑制剂的不利影响[73]，但还没有实现连续的甲醇生产。

Hogendoorn等[69]利用从火山地区分离出来的富马酸甲酯菌(Methylacidiphilum fumariolicum) SolV，实现了甲醇生物合成的实验室连续运行，并认为甲烷氧化菌可用于连续的甲醇生产。该菌属于疣状菌门(Verrucomicrobia)，只含有XoxF型MDH，需要镧系元素作为辅助因子。研究通过使用几乎不含镧系元素的培养基来降低甲醇脱氢酶的活性，获得了连续产甲醇的微生物培养物。在M. fumariolicum SolV菌生长率较高水平下，测定的最大甲醇转化率为63%，甲醇产生速率为0.88 mmol/(g DW·h)。该研究得到的稳定连续的甲醇产量为4.1 mmol/L，低于由MxaFI型MDH微生物得到的甲醇产量4–30 mmol/L[72-74]。

PHA这种微生物生成的胞内聚合物，因其优异的力学性能、生物降解性和生物相容性，有潜力成为油基塑料的替代品，其中PHB的相关研究较多。甲烷生物合成PHB成本较低，比以化石原料为基础的PHB生产传统工艺降低了30%–35%[75]。在PHB规模化生产中，MangoMaterials公司已实现以甲烷为原料、Ⅱ型MOB为主要菌株生产3-羟基丁酸酯(P3HB)，年产量约250 kg[76]。Newlight公司的产品Aircarbon是以甲烷为原料，在生物催化剂的作用下制成的长链热塑性材料，已实现22.7万t/年的规模化生产[77]。

在相关研究中，为了提高PHA的生产效率，常选取Ⅱ型甲烷氧化菌中的Methylocystis作菌源。多数PHA是在碳源过量而氮源饥饿时实现累积的，Ⅱ型甲烷氧化菌氧化甲烷后产生的二氧化碳中约50%被吸收到生物质中，Ⅰ型甲烷营养生物仅可吸收5%–15%。Ⅱ型甲烷氧化菌中最受关注的菌属为甲基孢囊菌属(Methylocystis)，在摇瓶、鼓泡塔生物反应器和垂直管式循环生物反应器中目标产品的累积率分别达到60%[78]、73.4%[79]和51.6%[80]。

添加铜离子、温度适宜和高传质反应器均有利于PHA的积累。铜离子浓度在5–15 μmol/L时，甲烷氧化菌生长速度随铜离子浓度增加而升高，但当浓度超过30 μmol/L时MOB生长会受到抑制。张婷婷[81]用甲烷营养菌群合成PHB的研究中，发现5 μmol/L铜离子条件下PHB合成能力从11.9%增至48.7%。Pérez等[82]发现对以Methylocystis (30%) 为主的甲烷氧化菌混合菌群，高温条件(30 ℃和37 ℃) 比25 ℃的常温更有利于PHA的积累，高温条件的PHA可占细胞干重的30%。Zúñiga等[83]通过创新反应器构型提高甲烷和氧气的传质效率，在两相生物反应器中实现了57%的PHB积累。

SCP按干重计一般含有50%–80%的蛋白质[84]，对于大多数必需氨基酸，尽管甲烷源细菌蛋白含量与鱼粉和豆粕的平均数据有微小差异，但必需氨基酸含量可与粮农组织的建议值相当或更高[85]，故单细胞蛋白生产技术仍持续推进。在国外，UniBio A/S和Calysta Inc都开发了发酵技术，通过使用甲烷营养细菌将天然气转化为动物饲料蛋白。UniBio A/S使用U形发酵罐，实现了4 kg/(m3·h)的生产率，生产具有约70%蛋白质的UniProtein®，该蛋白已被批准用于动物饲料。Calysta Inc.于2016年在英国开设了其产品FeedKind®的生产设施，并于2020年与Adisseo合资在重庆建设第一家单一菌株的单细胞蛋白商业规模生产设施。近年来，国内储卫华团队优化了甲烷氧化菌生产单细胞蛋白的发酵条件，为放大发酵提供基础[86]。辛嘉英团队[87]用甲烷氧化菌与光合菌协同生产单细胞蛋白用于饲料，为SCP生产提供了新的思路。

微生物油气勘探技术基于轻烃垂直微渗漏后表面环境微生物的变化，当检测到指示微生物(如甲烷氧化菌、丁烷氧化菌) 的密度不断增加，可以表明存在油气渗漏，存在地下碳氢化合物储集层。该技术能帮助确定钻探位置的优先次序，评估某个地区的油气勘探前景，提高勘探钻井的成功率。MOB勘探气藏的高频指示菌为甲基球菌、甲基杆菌和甲基孢囊菌[88]。

气藏地渗漏出的轻烃(C1–C4) 以甲烷为主，MOB以渗漏出的甲烷为唯一碳源和能源，专一性强，对判断页岩气、煤层气、常规油气和海洋天然气的分布情况有参考意义。汤玉平等[89]通过30个月的观测发现，烃类诱导下MOB数量随培养时间延长而增加，理论上利用微生物指示菌判识油气是有效的。袁志华等[2]对蠡县斜坡西柳构造已钻的探井结果统计发现，天然气微生物勘探结果的符合率约为83%。

传统的微生物勘探是基于微生物的培养，可分为土壤菌测法、细菌繁殖测量法、微生物勘探油气(microbial prospection for oil and gas, MPOG)、微生物石油勘探技术(microbial oil survey technique, MOST)。随着生物技术的发展，分子生物学检测方法与传统微生物勘探方法结合使用成为天然气勘探新的发展方向。培养法勘探的准确性受环境因素和难培养微生物的限制，免培养的分子生物学技术如稳定性同位素核酸探针技术能通过定量解析甲烷单加氧酶基因后验证油气藏位置和生产井位置，两者共同应用将提高勘探结果的准确率。

近几年，国内外利用甲烷氧化菌进行油气勘探有较多的应用实例。国内对多个油气田区块进行了甲烷氧化菌油气勘探，为缩小勘探范围提供了技术性支撑[2, 90-92]。印度研究者将指示烃氧化细菌数量与土壤轻烃吸附量结合，对坎贝盆地北[93]、Jamnagar次盆地[94]、Bikaner-Nagaur盆地[95]、Krishna-Godavari盆地[96]等进行探测，发现了异常烃类的微渗漏; 德国Micropro实验室在非洲中部等沙漠地区应用MPOG方法勘探油气藏。

利用甲烷氧化菌勘探油气藏离不开其他指标的帮助。由于甲烷可在没有石油矿藏的情况下出现，故还需结合其他长链烃氧化细菌的检测。此外，确定油气藏位置和布井位置需综合微生物勘探结果与结合各类化探指标。未来，在建立甲烷氧化菌分子生物学库、完善各种气藏甲烷氧化菌拉曼数据库等方面仍有大量工作要做。

出于对甲烷温室效应控制与资源化利用的需要，甲烷氧化菌成为一个有吸引力的高效微生物平台，可用于生成可再生燃料和化学品。在环境治理、化学品生产和油气藏勘测等领域也已经有规模化培养和实际应用。由于对好氧甲烷氧化菌代谢机制和种群关系认识的不足，好氧甲烷氧化菌的工程应用仍存在很多限制因素，需要在以下方面开展进一步研究。

(1) 基于代谢模型的生物转化调控

甲烷生物转化的实际工程应用需以提高甲烷转化率和产品产率为前提。Snehal等[97]基于M. alcaliphilum 20ZR已有的完整注释的基因组序列、大型酶制剂和转录组数据库，进行计算机模拟预测，并结合非靶向代谢组学和酶学的证据，提出了M. alcaliphilum 20ZR中甲烷和甲醇利用的综合代谢框架，并进行了数学建模。所建立的代谢模型框架为甲烷代谢工程或生态系统建模提供了有效的工具，有利于提高甲烷氧化细菌的产量和甲烷转化速率，以及探索甲烷生物转化调控的新方向。

该甲烷氧化细菌C1代谢框架模型可以预测多种甲烷及中间产物的代谢途径、不同的生物酶，基于此可以研究甲烷代谢过程的限制因素和条件，还可以人为有效控制不同酶的表达，实现对代谢产物的调控。如该模型的研究表明，用La取代Ca能引起甲烷氧化细菌核心代谢途径的显著改变，获得有价值的生物产品甲醇。还可以基于代谢模型探索甲烷生物转化调控的新方向，如发现钨元素存在下细胞中甲酸盐产生量显著减少，表明钨限制是导致甲酸盐积累的主要因素，通过控制钨而改变代谢产物组成。

(2) 混合培养的代谢过程和种群关系研究

对甲烷生物合成的研究大多基于对纯菌的分离和培养，约90%的研究用纯培养物来证明PHA/PHB积累的能力，这在大规模工业应用上的意义不大[98]。在工业生产中，单一培养系统会发生污染，对产率和产量的预测都会打折扣。混合的甲烷氧化菌是有益的：共生菌能去除有毒和过量产生的代谢物(如甲醇) 来改善甲烷氧化细菌的生长条件，还能提供必需维生素和生长因子，无需严格的无菌条件菌群也能保持长期稳定。

混合菌群的培养方法大多与纯菌类似，先对接种物进行富集，再经过多次传代培养得到稳定的甲烷代谢菌群。我们的研究中采用了不同的培养方式，即先通过类原位富集的方式获取接种物，接种物和培养基在甲烷条件下一次培养即可得到有效的甲烷氧化混合菌群，不需经过传代培养[15]。这种混合菌群的培养方法省时有效，尤其适用于含甲烷的生物废气的净化处理，该方式的应用和运行效果应进一步加以研究。

如何保证混合菌群稳定的甲烷氧化性能还需进一步研究。目前，甲烷氧化混合菌群的种群关系，代谢产物对种群结构的影响还不清楚，相关研究较少。甲烷氧化菌混合菌群的获得多基于种源直接培养，因缺乏对甲烷氧化菌种群间作用的生物化学机制及其调控方法的研究，难以实现高效稳定菌群的人工构建，对稳定菌群特征描述得更少。今后应加强对混合培养的代谢过程和种群关系方面的研究。

(3) 甲烷氧化菌新菌种的分离培养

从自然环境中分离甲烷氧化菌仍然具有挑战性。NMS培养基被广泛地用于各种环境中甲烷氧化菌的选择性富集。在富集过程中，当快速生长的菌株被选择性富集时，缓慢生长的甲烷氧化菌可能被稀释掉。Rhee等[99]的分子生态学研究也表明，用NMS富集出来的甲烷氧化菌在原环境中并不是主要的甲烷氧化菌。模型的研究也显示出了甲烷代谢的多样性，因此分离出更多特定环境中的新菌种，可以发现更多的可利用菌株和代谢酶类型。新的甲烷氧化菌的分离需要新的培养基和培养策略才能实现。如在分离特定甲烷氧化菌的过程中，Dedysh等使用稀矿物盐培养基成功地从泥炭沼泽中分离出中等嗜酸的甲烷氧化菌Methylocapsa和Methylocella[100]。

(4) 填埋气等生物废气的甲烷生物转化

目前欧洲很多国家都在积极推进温室气体减排的新战略，将CH4生物转化为高附加值产品已成为最有前景的方法之一[19]。垃圾填埋场、煤矿和厌氧消化装置都会产生沼气，可以替代天然气作为生物合成的甲烷来源，而不是被收集后简单氧化或燃烧。国外很多研究都已针对碳基废物资源的甲烷转化进行研究[101]，包括富含有机物的生活/工业废水和固体废物发酵产气和工业气体，我国目前类似的研究还较少。我国垃圾分类出来的厨余垃圾多进行厌氧发酵，对其产生的沼气进行生物合成的研究，可以增加厨余垃圾资源化处理的收益，有利于垃圾分类收集处理体系的实现。

对于以上环境沼气中甲烷转化的工程应用，实验室的培养方法会限制甲烷氧化菌使用的规模和范围，高成本的培养基，尤其是甲烷氧化菌高密度生长的培养基所需试剂多且贵，培养成本高。以矿化垃圾、煤等天然材料与具有优良表面性质的填料结合将是甲烷生物过滤器的填料发展方向，能在降低填料成本的同时兼顾传质效果，还能为微生物提供各种营养物质。其他经济高效的替代培养基和培养技术的研究将有利于甲烷氧化菌生物技术的推广。