细胞焦亡法破碎微生物细胞在合成生物学与代谢工程的应用

细胞焦亡最初是巨噬细胞受到病原体侵害后的一种激活炎症反应，是一种细胞程序性死亡方式；它的发生依赖于炎性caspase的激活，从而对gasdermin蛋白家族的多个成员进行剪切，释放gasdermin蛋白N端结构域形成多聚体[1-3]。Gasdermin蛋白N端结构域具有结合膜脂的活性，其多聚体形成网状结构，从而使得在膜上形成小孔[4]。由于细胞内外渗透压不同，细胞吸水胀破死亡[5]。在细菌和古细菌中存在与gasdermin同源的基因[6]。Johnson等证明来自微生物细胞的gasdermin类蛋白具有介导细胞焦亡的功能，从而确定细胞焦亡也存在于微生物中且原理相同(图 1)；细胞焦亡在原核细胞中可能是一种“防御系统”，在受到病毒(噬菌体)的攻击中通过细胞焦亡来稳定群体[7]。

合成生物学利用人工设计的代谢调控通路构建出全新的生物系统[8]。随着合成生物学的不断发展，生物系统在生物医药、天然产物合成、工农业、生物能源等诸多领域具有广泛的应用[9-10]。天然生物系统往往可以被人工改造成生物学工具，应用于基础研究、生物医药、生物制造和合成生物学等领域。例如，CRISPR系统常常被改造成基因编辑工具，在基础研究和应用过程中被广泛使用[11]。在合成生物学与代谢工程的应用过程中，微生物细胞破碎是不可或缺的一步。例如，在制备蛋白产品或是胞内化合物，需要通过细胞破碎将蛋白质和产物释放到细胞外，进行进一步的分离纯化处理[12-13]。微生物细胞破碎的方式包括机械法和非机械法[14]。非机械法采用价格较高的溶菌酶等手段，存在破碎率低等缺陷[15]。利用机械法包括超声破碎、匀浆机等破碎细胞是当前的主流，但这些机械法破碎微生物细胞时因温度升高等原因会影响蛋白或化合物的功能[16]。细胞焦亡法破碎微生物细胞是一种温和、高效的破碎方式，适用范围广、操作简便。细胞焦亡法破碎微生物细胞在合成生物学与代谢工程中能够优化生产工艺降低生产成本，绿色节能环保。

本工作中使用的所有菌株和质粒见表 1。用大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α构建质粒，以E. coli BW25113为相应蛋白表达及应用的宿主。所采用载体pLB1s和pYB1k为araBAD启动子及rrnB终止子，载体pSL91c使用组成型表达的119启动子。编码Bradyrhizobium tropiciagri、Vitiosangium sp.、Desulfuromonadales和Runella sp.这4种来源的gasdermin (GSDM)基因以及Runella来源的protease基因均由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成。编码蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase, BASP)的基因由通用生物(安徽)股份有限公司人工合成。

限制性内切酶、高保真DNA聚合酶和Gibson试剂盒，Vazyme Biotech公司；蔗糖、葡萄糖、果糖和纤维二糖，上海盛思生化有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；DNS溶液，深圳市文乐生物科技有限公司。凝胶电泳仪，Bio-Rad公司；酶联免疫检测仪，上海旦鼎国际贸易有限公司；多功能高真空镀膜仪和日立冷场发射扫描电镜，Hitachi公司。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0。M9无机盐溶液(g/L)：十二水合磷酸氢二钠17.0，磷酸二氢钾3.0，氯化铵1.0，氯化钠0.5[17-18]。氯霉素(50 mg/mL)、硫酸链霉素(50 mg/mL)或卡那霉素(50 mg/mL)根据需要添加至培养基中。

试验中所使用的引物见表 2。质粒的构建依据同源重组的原理[19]。利用引物NcoI-F和XhoI-R构建NcoI-BGSDM-XhoI片段，Nco I、Xho I酶切质粒pSL91c后得到质粒pSL91c骨架片段。NcoI-BGSDM-XhoI片段和质粒pSL91c骨架片段利用Gibson组装成质粒pSL91c- BGSDM。同样的方法将VGSDM (Vitiosangium sp.来源)、DGSDM (Desulfuromonadales来源)和RGSDM (Runella sp.来源)构建到质粒pSL91c上。利用引物NcoI-Ru protease-R和XhoI-Ru protease-F构建NcoI-RP-XhoI片段，Nco Ⅰ、Xho Ⅰ酶切质粒pLB1s和pYB1k后得到质粒pLB1s骨架片段和质粒pYB1k骨架片段。NcoI-RP-XhoI片段利用Gibson分别与质粒pLB1s骨架片段和质粒pYB1k骨架片段组装成质粒pLB1s-RP和pYB1k-RP。利用引物RGSDM jd-F和XhoI-Ru GSDM jd-R构建质粒pLB1s- RGJD和pYB1k-RGJD。测序正确后将不同来源GSDM基因的质粒pSL91c-GSDM与质粒pLB1s-RP共转入BW25113中构建出菌株B1、B2、B3和B4。将质粒pYB1k-RP和pSL91c- RGSDM共转入BW25113构建出菌株B9K。将质粒pLB1s-RGJD、pYB1k-RGJD和pUB1k-RGJD分别转入BW25113中构建出菌株BJS、BJK和BUK。利用引物NcoI-BasPase-F和XhoI-BasPase-R构建质粒pSL91c-BASP，转入菌株BJK中构建出BJKBP。

按照1%接种量将菌株B1、B2、B3和B4接种在添加氯霉素(终浓度50 µg/mL)和硫酸链霉素(终浓度50 µg/mL)的液体LB培养基中；将菌株B9K接种在添加氯霉素(终浓度50 µg/mL)和卡那霉素(终浓度50 µg/mL)的液体LB培养基中；将菌株BJS接种在添加硫酸链霉素(终浓度50 µg/mL)的液体LB培养基中；将菌株BJK和BUK接种在添加卡那霉素(终浓度50 µg/mL)的液体LB培养基中。37 ℃、220 r/min摇床培养至生长稳定期即12 h后加入诱导剂(终浓度为0.2%的阿拉伯糖)，继续37 ℃、220 r/min摇床培养。每2 h记录下菌液OD600值，观察在加入诱导剂后菌株OD600值的变化并绘制成菌株诱导生长曲线图。

菌株B4在1.3所述的条件下培养，分别在加入诱导剂后0.5、1、2、6和12 h取样进行扫描电镜观察。制样：取约20−30 µL菌体于离心管中，用戊二醛重悬，在室温中至少静置30 min后放置于4 ℃冰箱中8 h以上。吸出戊二醛固定液，加入去离子水浸泡样品4 min，5 000 r/min离心2 min；吸出去离子水，再加入去离子水浸泡5 min，5 000 r/min离心2 min；吸出去离子水，再加入去离子水浸泡6 min，5 000 r/min离心2 min；吸出去离子水，加入50%乙醇浸泡14 min；吸出乙醇，加入70%乙醇浸泡14 min；吸出大部分乙醇，留取约100 µL 70%乙醇重悬，将菌液滴入滤纸包裹的载玻片上(纸包)；将纸包放置于培养皿中，加入85%乙醇浸泡14 min；倒出乙醇，加入95%乙醇浸泡14 min；倒出乙醇，加入100%乙醇浸泡15 min (100%乙醇浸泡过程重复3次)；取出纸包，烘干；取出纸包中的载玻片在多功能高真空镀膜仪中镀膜；利用扫描电镜观察大肠杆菌细胞表面形态和结构[20]。

按照1%接种量将菌株B4接种在添加氯霉素(终浓度50 µg/mL)和硫酸链霉素(终浓度50 µg/mL)的液体LB培养基中，37 ℃、220 r/min摇床培养3 h后放入25 ℃、220 r/min摇床中培养12 h，5 000 r/min离心10 min收集菌体。利用M9盐溶液溶解菌体后分成两组，一组加入诱导剂诱导菌株发生细胞焦亡；另一组控制试验条件与前一组相同但不加入诱导剂。将两组菌液放置于37 ℃、220 r/min摇床培养，每2 h取1 mL菌液，5 000 r/min离心10 min取上清，利用BCA法测定上清中可溶性蛋白含量。

选取菌株B9K和BJK进行活菌计数检测。菌株在1.3所述的条件下培养，在培养12 h和加入诱导剂继续诱导12 h分别取1 mL菌液作为样品。各样品菌液连续稀释103、104、105、106和107倍。取各稀释倍数的200 µL菌液均匀地涂布在相应氯霉素(终浓度50 µg/mL)或卡那霉素(终浓度50 µg/mL)的固体LB平板上，放置于37 ℃培养箱中培养12 h后取出计数[21]。

按照1%接种量将菌株B4、B9K、BJS、BJK和BUK接种在添加相应氯霉素(终浓度50 µg/mL)、硫酸链霉素(终浓度50 µg/mL)或卡那霉素(终浓度50 µg/mL)的液体LB培养基中，37 ℃、220 r/min摇床培养12 h后加入诱导剂(终浓度为0.2%的阿拉伯糖)，诱导表达12 h后5 000 r/min离心10 min收集菌体，进行SDS-PAGE。按照1%接种量将菌株BJKBP接种在添加氯霉素(终浓度50 µg/mL)和卡那霉素(终浓度50 µg/mL)的液体LB培养基中，37 ℃、220 r/min摇床培养3 h后放入25 ℃、220 r/min摇床中培养12 h，5 000 r/min离心10 min收集菌体，进行SDS-PAGE[22]。

菌株BJKBP在与上述SDS-PAGE的相同培养条件下培养并收集菌体。不同生物量的菌体溶于1 mL M9盐溶液中制备成1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 OD/mL (OD600)菌液，再分别利用细胞焦亡法或超声法破碎菌株细胞制备蔗糖磷酸化酶粗酶液。蔗糖磷酸化酶粗酶液根据反应体系[500 µL 10%蔗糖、480 µL 100 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)、20 µL粗酶液]在37 ℃反应釜中反应5 min，12 000 r/min离心5 min取上清，利用DNS法测定上清中果糖含量的吸光值(A540)。蔗糖和磷酸在蔗糖磷酸化酶的作用下生成G-1-P和果糖(图 2)，利用DNS法测定果糖含量的吸光值(A540)来比较超声法和细胞焦亡法制备粗酶液的相对酶活[23-24]。

为了筛选出合适的细胞焦亡介导蛋白GSDM，本研究克隆了Bradyrhizobium tropiciagri、Vitiosangium sp.、Desulfuromonadales和Runella sp.这4种不同来源的GSDM及Runella sp.来源的protease，并分别构建质粒。将带有不同来源GSDM基因的质粒pSL91c-GSDM与质粒pLB1s-RP共转入BW25113，获得菌株B1、B2、B3和B4。

试验结果表明，菌株B1、B2和B3在加入诱导剂后菌液的OD600值未见明显变化；而菌株B4在加入诱导剂后菌液的OD600值迅速下降，并在诱导2 h后下降到最低点(图 3)。推测原因是当Runella sp.来源的GSDM和protease (菌株B4)共表达时，引发了细胞焦亡效应，导致菌株细胞破碎，使菌液的光密度降低。

为了进一步验证细胞是否发生焦亡，对菌株B4诱导前后的细胞进行了扫描电镜观察[25]。观察结果显示，菌株B4诱导前细胞形态饱满完整，未发现细胞形态的改变(图 4A)；菌株B4诱导0.5 h后大量的细胞开始发生形态上的变化，细胞呈现透明状且形态结构发生扭曲变形，可见多处破损甚至出现细胞碎片(图 4B)；利用细胞计数器对诱导前后细胞进行计数，诱导前共发现370个细胞(图 4C)；诱导0.5 h后细胞大量减少，仅发现80个细胞，其中有72个细胞呈现透明状并且形态结构发生扭曲变形(图 4D)。

对诱导后的菌株细胞进一步放大观察，发现膜结构已被破坏，细胞破裂(图 4E)。膜上形成了直径大约为20 nm的孔隙(图 4F)。试验结果表明，菌株B4诱导后能在细胞膜上形成孔隙，这些孔隙使得细胞吸水胀破，进而导致细胞破碎。结合上述试验结果，验证了菌株B4在诱导表达焦亡相关蛋白后能引发细胞焦亡效应，导致菌株细胞破碎。

菌株B4在诱导发生细胞焦亡后菌株细胞破碎。为了确定菌株细胞破碎后细胞内容物的去向，本研究设计了焦亡菌株破碎细胞后胞外可溶性蛋白含量检测试验。

试验结果显示，菌株B4诱导发生细胞焦亡后，细胞破碎，上清中的蛋白含量显著提高。在6 h后，上清中的蛋白含量最多达到450 mg/L。而菌株B4非诱导细胞焦亡时，上清中的蛋白含量未发生明显变化，保持在50 mg/L (图 5)。以上结果验证了菌株B4经诱导后引起焦亡效应。在细胞发生破碎的同时，细胞内容物可以有效释放到培养基(胞外)中。

为了进一步提高菌株发生细胞焦亡的效率，本研究通过增加载体拷贝数的方式提高protease的表达量，构建质粒pYB1k-RP，并和质粒pSL91c-RGSDM共转入BW25113，获得菌株B9K。同时对Runella sp.来源的GSDM进行截短改造，获得截短体GSDMJD。在诱导表达GSDMJD后，直接引发细胞焦亡，从而使得细胞破碎。将截短体分别克隆至具有不同拷贝数的载体得到质粒pLB1s-RGJD、pYB1k-RGJD和pUB1k-RGJD，并分别转入BW25113，获得菌株BJS、BJK和BUK。

将上述菌株诱导后进行SDS-PAGE分析。根据SDS-PAGE图(图 6)显示，GSDM蛋白分子量为30 kDa。诱导发生焦亡后，GSDM蛋白条带大小由30 kDa变为28 kDa，表明其C端小肽被降解；且在提高protease的表达后，可溶性的GSDM的C端小肽完全降解。电泳图 5B中未见到明显的GSDMJD蛋白条带，这可能是由GSDMJD引发焦亡后细胞迅速破碎并未积累一定量的GSDMJD所引起的。

对上述重组菌株进行诱导生长曲线测试，结果显示(图 7)，各菌株在加入诱导剂诱导发生焦亡后，菌液的OD600值急剧下降，并在诱导2 h后菌液的OD600值下降到最低点。其中，菌株B9K、BJK和BUK菌液的OD600值最低点低于菌株B4、BJS的菌液的OD600值最低点。然而，菌株BUK在其菌液的OD600值下降到最低点后出现了回升现象，进一步基因测序结果表明菌株BUK出现了突变，因此不适合作为大肠杆菌细胞焦亡菌株。

进一步对菌株B9K和BJK进行活菌计数检测，菌株BJK诱导前活菌数为2.25×109 CFU/mL (图 8A)；诱导12 h后活菌数为6.5×104 CFU/mL (图 8B)；死亡率为99.997%。菌株B9K诱导前活菌数为3.9×109 CFU/mL (图 8C)；诱导12 h后活菌数为1.37×106 CFU/mL (图 8D)；死亡率为99.965%。上述结果表明，虽然菌液OD600值未发生变化，但大部分细胞已经死亡。试验结果验证了细胞焦亡法能有效使大肠杆菌破碎死亡，焦亡菌株BJK的效果更为显著。此外，根据诱导生长曲线和基因测序显示，本菌株性质稳定，不易发生突变。综上所述，菌株BJK是作为可控细胞焦亡的最优菌株。

为了验证细胞焦亡法破碎细胞对胞内产物的影响，本研究在制备蔗糖磷酸化酶粗酶液的应用中，对比了细胞焦亡法破碎和超声破碎得到的粗酶液的相对酶活。将表达蔗糖磷酸化酶的质粒pSL91c-BASP转入焦亡菌株BJK中，构建出菌株BJKBP。根据菌株BJKBP的SDS-PAGE图显示，BASP蛋白分子量约55 kDa (图 6)。菌株BJKBP表达蔗糖磷酸化酶后，利用细胞焦亡法和超声法制备成粗酶液。

结果显示，在制备粗酶液的生物量即菌液OD600值为1.0、2.0、4.0和6.0时，细胞焦亡法制备的粗酶液的相对酶活显著高于超声法制备粗酶液的相对酶活。在制备粗酶液的菌液OD600值为2.0时，细胞焦亡法制备的粗酶液相对酶活最高，且比超声法制备粗酶液的相对酶活提高了60%。在制备粗酶液的菌液OD600值为8.0、10.0时，蔗糖磷酸化酶酶量充足，细胞焦亡法制备的粗酶液与超声法制备的粗酶液的相对酶活相同(图 9)。试验结果表明，细胞焦亡法破碎大肠杆菌后内容物释放且更好地保留了胞内产物的活性。并且此方法仅需在表达相关酶后，加入诱导剂即可破碎细胞用于检测酶活，极大地减少了工作量，优化了生产工艺。综上所述，细胞焦亡法破碎微生物细胞可取代超声破碎成为代谢工程与合成生物学中的重要技术手段。

本研究验证了细胞焦亡确实可以使大肠杆菌细胞破碎。该细胞焦亡系统具有严谨且破碎效率高等特性。焦亡菌株在诱导表达焦亡相关蛋白2 h后大肠杆菌细胞破碎死亡，内容物释放。Protease处理后的GSDM和GSDMJD的表达水平对焦亡具有重要影响。通过进一步的表达优化，最终获得可控细胞焦亡的最优菌株BJK。另一方面，将上述系统和超声法应用于制备蔗糖磷酸化酶粗酶液中，细胞焦亡法制备的粗酶液的相对酶活显著高于超声法制备粗酶液的相对酶活。在制备粗酶液的菌液OD600值为2.0时，细胞焦亡法制备的粗酶液相对酶活最高，并且比超声法制备粗酶液的相对酶活提高60%。细胞焦亡法仅需加入诱导剂诱导一定时间，即可破碎微生物细胞制备成粗酶液，操作简单快捷，极大地减少了工作量，优化了生产工艺。综上所述，细胞焦亡法可以取代传统的微生物细胞破碎方式。在合成生物学与代谢工程中，细胞焦亡法破碎微生物细胞会逐渐成为新的生物学技术手段，让生物合成取代化学合成并成为主流。