一种通过生物电化学还原CO2产甲烷的方法与流程

本发明涉及co2资源化利用领域，尤其涉及一种通过生物电化学还原co2产甲烷的方法。

背景技术：

co2作为主要的温室气体之一，其在大气中含量增长可能导致全球变暖和气候极端事件增加。如何有效减少大气中co2的排放，并将其转化为高附加值化学品成为全球研究的热点。常见的转化方法包括化学转化和生物转化。化学法往往需要高温高压和催化剂，与之相比，生物转化可以在室温常压条件下发生，反应条件温和，有着广阔的应用前景。

利用生物电化学系统将co2还原产生甲烷是目前的研究热点之一。当生物电化学系统中仅有产甲烷菌(如methanosarcina)存在时，其可以通过直接电子传递途径利用电子还原co2产生甲烷，如方程(2-1)；也可以通过氢气介导的间接电子传递途径产生甲烷，如方程(2-2和2-3)。其中，直接电子传递途径产甲烷所需电势的绝对值比氢气介导的间接电子传递产甲烷途径更小。有研究指出，当通过直接电子传递途径还原co2产甲烷时，热力学能量输入值为11kwh·m-3ch4，而在相同条件下通过氢气介导的间接电子传递途径还原co2产甲烷时，热力学能量输入值为25.5kwh·m-3ch4(microbialcommunityanalysisofamethane-producingbiocathodeinbioelelctrochemicalsystem,archeae,2013,9:1155-1167)。相比于氢气介导的间接电子传递途径，直接电子传递途径产生单位体积甲烷所消耗的能量更小，且不易受到分子态氢在水中溶解度低的影响。由此，生物电化学系统中直接/氢气介导的间接电子传递产甲烷途径的识别，对于选择合适的反应条件以提高生物电产甲烷速率至关重要。但是，目前对生物电化学系统中产甲烷途径的分析还没有直接、简单的方法。

co2+8e-+8h+→ch4+2h2oe'o＝-0.24v(25℃，ph＝7)(2-1)

2h++2e-→h2e'o＝-0.41v(25℃，ph＝7)(2-2)

co2+4h2→ch4+2h2oδgo’＝-135kj/mol(2-3)

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种针对性强、操作简单快捷的通过生物电化学还原co2产甲烷的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。

一种通过生物电化学还原co2产甲烷的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测生物电化学反应体系及对照体系中产甲烷菌的rna，具体如下：在生物电解池池体中加入培养液并接种产甲烷菌，所述的产甲烷菌为巴氏甲烷八叠球菌(methanosarcinabarkeri)；产甲烷菌接种量为10～30％；得到的电解池连接到电化学工作站上，即构成待测生物电化学反应体系；通过电化学工作站对反应体系施加-1.2～0v的电势，反应48～72h。

所述的对照体系，采用上述同样的方式，接种相同量的产甲烷菌，施加-0.35v或0v的电势，反应48～72h。

在待测生物电化学反应体系及对照体系进行电化学反应后得到的菌液样品中，以10％比例添加体积比为95:5的无水乙醇-trizol溶液，在厌氧手套箱里将固定后的菌液置于离心管中，4℃下12,000×g离心20min收集细胞，然后采用trizol试剂法进行提取rna；

(2)将提取的rna反转录成cdna；

a)配制消化降解dna体系：取体积比为2:2:0.2:15.8的复合dna降解酶i(recombinantdnasei)、10倍dna酶i缓冲液(10×dnaseibuffer)、复合rna降解酶抑制剂(recombinantrnaseinhibitor)和步骤(1)提取的rna混合；

b)取上述消化降解dna体系置于新的pcr管中，加入随机引物(random6mers序列：pd(n)6)，75℃水浴内加热10min后，迅速在冰上冷却2min，离心5s；其中消化降解dna体系与随机引物的体积比为6.5:0.5；

c)配制10μlrna反转录体系：将体积比为2:0.5:0.25:0.25:7的5倍逆转录酶m-mlv缓冲液(5×reversetranscriptasem-mlvbuffer)、2’-脱氧核苷酸-5’-三磷酸混合物(dntpmix)、逆转录酶m-mlv(rnaseh-)(reversetranscriptasem-mlv(rnaseh-))、重组rna酶抑制剂(recombinantrnaseinhibitor)和步骤b)得到的体系，放置于pcr仪中进行反转录；pcr反应升温程序为：30℃保持10min，42℃保持60min，70℃保持15min，结束后冷却至室温，得到cdna溶液。

(3)分别采用功能基因ccda和frhb的特异性引物对获得的cdna进行荧光定量pcr；

所述的功能基因ccda和frhb的特异性引物序列分别为：

ccdaf(tgacagagactcgagacgga)；

ccdar(gcctgctgccagaagtaaga)；

frhbf(gcccggtcttggaattgtcaaaaa)；

frhbr(cgccttattaaccccaaaattcct)；

所述的荧光定量pcr采用的荧光定量pcr扩增反应体系的组成为：体积比为3.6:0.2:5:1的无菌水、12.5μm的正向和反向引物、tbgreenpremixextaqii和cdna样品，扩增体系中cdna样品的含量，浓度>20ng/μl；

所述的荧光定量pcr的扩增程序为：95℃保持5min；94℃保持45s，62℃保持45s,循环45次；最后72℃保持45s。

(4)计算两种功能基因表达量的比值，r＝ccda(copies/ml)/frhb(copies/ml)与对照体系进行比较，由此判断产甲烷途径，在哪种反应条件下获得基因表达量的比值与对照体系(如仅有直接电子传递产甲烷途径的对照体系)进行比较，如果比值接近，说明在此条件下含有直接电子传递途径的比例相对较高，并结合产甲烷量综合考虑选择反应条件产生甲烷。

步骤(4)所述的对照体系，选用-0.35v无氢气即仅有直接电子传递途径和0v且有氢气即仅有氢气介导的间接电子传递途径的两种产甲烷体系。

本发明具有以下优点及有益的技术效果：

细胞色素c是一类细胞膜结合的蛋白，对电子的跨膜传输起着关键作用，功能基因ccda对合成细胞色素c有着重要作用。frhb是编码f420还原酶的功能基因，f420还原酶可以催化f420与h2在胞内生成f420h2，进而参与到产甲烷途径中。此外，f420还原酶并不会参与电子的跨膜传输过程，不会参与直接电子传递途径。因此，功能基因ccda和frhb的表达量可以分别指示直接电子传递和氢气介导的间接电子传递产甲烷途径的活性。

本发明在rna水平采用特异性引物结合荧光定量pcr的方法，直接获得功能基因ccda和frhb的表达量，通过比例计算进而判定体系中直接电子传递和氢气介导的间接电子传递产甲烷途径，并由此选择与途径对应的培养条件，进行甲烷生成。本方法为实际应用中选择低能耗、高产甲烷量的反应条件提供了直接的技术支持，且特异性强、操作简便、检测准确，对生物电化学还原co2产甲烷的应用具有重要意义。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明作进一步的详细描述，以下实施例可使本专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明，该领域的熟练技术人员可以根据上述发明的内容做出一些非本质性的改进和调整。

下面各实施例中用到的生物电解池为常规的生物电解池，如(包含阴极池和阳极池的微生物电解池，阴极池中包含工作电极、参比电极；阳极池包括对电极；阴极池和阳极池之间用质子交换膜隔开)，生物电解池池体内加入的培养液为(培养基的配方：0.35g/lk2hpo4、0.23g/lkh2po4、0.5g/lnh4cl、0.5g/lmgso4·7h2o、0.25g/lcacl2、2.25g/lnacl、0.85g/lnahco3、0.5g/lna2s·h2o、10ml/l微量元素溶液和1ml/l维生素溶液。微量元素溶液配方：1500mg/lfecl2·4h2o、70mg/lzncl2、100mg/lmncl2·4h2o、6mg/lhbo3、190mg/lcocl2·6h2o、2mg/lcucl2·h2o、24mg/lnicl2·6h2o、36mg/lnamo4·2h2o和hcl(25％)10ml/l；维生素溶液配方：2mg/l生物素、2mg/l叶酸、10mg/l维生素b6、5mg/l维生素b1、5mg/l维生素b2、5mg/l烟碱酸、5mg/l泛酸、0.1mg/l维生素b12、5mg/l氨基苯甲酸和5mg/l硫辛酸)；

电化学工作站为常规的电化学工作站，如(corrtestcs3140电化学工作站)；

复合dna降解酶购自takarabio(日本)

10倍dna酶i缓冲液购自takarabio(日本)

复合rna降解酶抑制剂购自takarabio(日本)

5倍逆转录酶m-mlv缓冲液购自takarabio(日本)

2’-脱氧核苷酸-5’-三磷酸混合物购自takarabio(日本)

逆转录酶m-mlv(rnaseh-)购自takarabio(日本)

重组rna酶抑制剂购自takarabio(日本)。

实施例1

以胜利油田样品中分离到的一株methanosarcinabarkeri为待检测物，在生物电解池池体中加入培养液并接种该产甲烷菌，将电解池连接到电化学工作站上，按照以下方法检测产甲烷的优化条件：

(1)提取待测生物电化学反应体系及对照体系中产甲烷菌的rna：建立接种methanosarcinabarkeri培养液的厌氧生物电化学反应体系，接种量为10％，设置电势为-0.8v，室温反应，对照体系为0v且有氢气(仅有氢气介导的间接电子传递途径)和-0.35v无氢气(仅有直接电子传递途径)。反应60h后，测定反应体系的池体中产甲烷量为1.35μmol，对照体系池体中产甲烷量分别为0.12和0.01μmol。菌液样品中以10％比例添加体积比为95:5无水乙醇-trizol溶液，在厌氧手套箱里将固定后的菌液置于离心管中，4℃下12,000×g离心20min收集细胞，采用trizol试剂法进行提取rna。

(2)将提取的rna反转录成cdna：

a.配制20μl消化降解dna体系：2μl复合dna降解酶i、2μl的10倍dna酶i缓冲液、0.2μl复合rna降解酶抑制剂和15.8μlrna；

b.取6.5μl上述消化降解dna体系置于新的pcr管中，加入0.5μl随机引物(random6mers序列：pd(n)6)，75℃水浴内加热10min后，迅速在冰上冷却2min，离心5s；

c.配制10μlrna反转录体系：2μl的5倍逆转录酶m-mlv缓冲液、0.5μl的2’-脱氧核苷酸-5’-三磷酸混合物、0.25μl逆转录酶m-mlv(rnaseh-)、0.25μl重组rna酶抑制剂和7μl步骤b所得体系，放置于pcr仪中进行反转录；pcr反应升温程序为：30℃保持10min，42℃保持60min，70℃保持15min，结束后冷却至室温。

(3)得到的cdna溶液分别采用ccda(正向：tgacagagactcgagacgga和反向：gcctgctgccagaagtaaga)和frhb(正向：gcccggtcttggaattgtcaaaaa和反向：cgccttattaaccccaaaattcct)的特异性引物对获得的cdna进行荧光定量pcr。荧光定量pcr扩增反应体系组成为：3.6μl无菌水、0.2μl的12.5μm正向和反向引物、5μltbgreenpremixextaqii和1μl的cdna样品。所述的荧光定量pcr扩增程序为：95℃保持5min；94℃保持45s，62℃保持45s,循环45次；最后72℃保持45s。

(4)检测到反应体系中ccda的表达量为2115copies/ml，frhb的表达量为1247copies/ml，计算得到r反应体系＝ccda/frhb＝1.70。而对照体系0v且有氢气(仅有氢气介导的间接电子传递途径)和-0.35v无氢气(仅有直接电子传递途径)中ccda的表达量分别为693/1744copies/ml，frhb的表达量分别为454/797copies/ml，r对照＝ccda/frhb＝1.53/2.19。由于2.19>r反应体系>1.53，表明与对照体系相比，直接电子传递产甲烷途径比例增大。

(5)调节步骤1中的电势值-1.2～0v，重复步骤1～4，测得当电势值为-1.0v时，甲烷产量可达9.53μmol，与对照体系相比更靠近-0.35v无氢气(仅有直接电子传递途径)时基因表达量的比值，因此，在调节电势值为-1.0v，对胜利油田分离到的一株methanosarcinabarkeri采用生物电化学方法进行产甲烷反应，结果表明，产甲烷量可达9.53μmol，是-1.2和-0.4v电势下产甲烷量的1.05和79倍，且能耗低。

实施例2

以江苏油田样品中分离到的一株methanosarcinabarkeri为待检测物，在生物电解池池体中加入培养液并接种该产甲烷菌，将电解池连接到电化学工作站上，按照以下方法检测产甲烷的优化条件：

(1)提取待测生物电化学反应体系及对照体系中产甲烷菌的rna：建立接种methanosarcinabarkeri培养液的厌氧生物电化学反应体系，接种量为30％，设置电势为-0.5v，室温反应，对照体系为0v且有氢气(仅有氢气介导的间接电子传递途径)和-0.35v无氢气(仅有直接电子传递途径)。反应72h后，测定反应体系的池体中产甲烷量为0.45μmol，对照体系池体中产甲烷量分别为0.21和0.02μmol。菌液样品中以10％比例添加15ml体积比为95:5无水乙醇-trizol溶液，在厌氧手套箱里将固定后的菌液置于离心管中，4℃下12,000×g离心20min收集细胞，采用trizol试剂法进行提取rna。

(2)将提取的rna反转录成cdna：

a.配制20μl消化降解dna体系：2μl复合dna降解酶i、2μl的10倍dna酶i缓冲液、0.2μl复合rna降解酶抑制剂和15.8μlrna；

b.取6.5μl上述消化降解dna体系置于新的pcr管中，加入0.5μl随机引物(random6mers序列：pd(n)6)，75℃水浴内加热10min后，迅速在冰上冷却2min，离心5s；

c.配制10μlrna反转录体系：2μl的5倍逆转录酶m-mlv缓冲液、0.5μl的2’-脱氧核苷酸-5’-三磷酸混合物、0.25μl逆转录酶m-mlv(rnaseh-)、0.25μl重组rna酶抑制剂和7μl步骤b所得体系，放置于pcr仪中进行反转录；pcr反应升温程序为：30℃保持10min，42℃保持60min，70℃保持15min，结束后冷却至室温。

(3)得到的cdna溶液分别采用ccda(正向：tgacagagactcgagacgga和反向：gcctgctgccagaagtaaga)和frhb(正向：gcccggtcttggaattgtcaaaaa和反向：cgccttattaaccccaaaattcct)的特异性引物对获得的cdna进行荧光定量pcr。荧光定量pcr扩增反应体系组成为：3.6μl无菌水、0.2μl的12.5μm正向和反向引物、5μltbgreenpremixextaqii和1μl的cdna样品。所述的荧光定量pcr扩增程序为：95℃保持5min；94℃保持45s，62℃保持45s,循环45次；最后72℃保持45s。

(4)检测到反应体系中ccda的表达量为1795copies/ml，frhb的表达量为965copies/ml，计算得到r反应体系＝ccda/frhb＝1.86。而对照体系0v且有氢气(仅有氢气介导的间接电子传递途径)和-0.35v无氢气(仅有直接电子传递途径)中ccda的表达量分别为577/1534copies/ml，frhb的表达量分别为406/763copies/ml，r对照＝ccda/frhb＝1.42/2.01。由于2.01>r反应体系>1.42，表明与对照体系相比，直接电子传递产甲烷途径比例增大。

(5)调节步骤1中的电势值-1.0～0v，重复步骤1～4，测得当电势值为-0.9v时，甲烷产量可达8.32μmol，与对照体系相比更靠近-0.35v无氢气(仅有直接电子传递途径)时基因表达量的比值，因此，在调节电势值为-0.9v，对江苏油田分离到的一株methanosarcinabarkeri采用生物电化学方法进行产甲烷反应，结果表明，产甲烷量可达8.32μmol，是-1.0和-0.4v电势下产甲烷量的2和46倍，且能耗低。