药物靶点发现及研究的多种创新技术应用 2022年6月10日/医麦客新闻 eMedClub News/

来源：雪球App，作者： 医麦客，（https://xueqiu.com/5603603160/222241867）

2022年6月10日/医麦客新闻 eMedClub News/--药物大多通过与人体内“靶标”分子的相互作用而产生疗效。新的药物作用靶点是一系列新药发现的突破口，寻找药物作用的新靶点，已成为当今创新药研究激烈竞争的焦点。

从药物开发角度来看，药物的效果很大程度上取决于它的靶标。一些难以征服的疾病至今仍然疗效不理想或出现严重副作用，是因为目前还没有找到合适的药物作用靶标。

一个好的靶点应该是安全、有效且符合临床和商业的要求，并且是“可成药的”。理想的药物靶点一般具备以下的特征：首先，生物大分子可以单独存在或形成聚合体；其次，具有可以与其他结构物质相结合的部位或位点；再次，该物质的结构可以变化，发挥生理调节作用；还有该物质结构产生的生理效应需在复杂的调节过程中起主要作用；最后体内可能存在内源性与之结合的小分子或外源性配基，其配基具有药理作用且被认识。

作为药物开发极为关键的一环，发现潜在治疗靶点的功能及其在疾病中的作用是靶点发现和特征鉴定的开始。靶点发现流程一般是先利用基因水平、蛋白水平、细胞水平的技术获取疾病相关的生物分子信息，并进行生物信息学分析；再对相关的生物分子进行功能研究，从而确定候选药物作为靶标。

从具体方法来说，目前已有各种不同的筛选和研究手段来寻找药物靶点，包括表型筛选、基因关联研究、化学蛋白质组学、转基因生物、成像、生物标志物和许多其他方法。

➤基因水平

近年来，迎来了药物开发史上诸多重要里程碑，例如第一个获得FDA批准的癌症基因疗法(Kymriah™) 和遗传性疾病基因疗法 (LUXTURNA™)以及第一个基于肿瘤的遗传特征而非部位的癌症药物 (Keytruda ®)。这都意味着我们已经进入了一个能够通过调控疾病相关基因来开发治疗策略的新时代。

传统的药物发现是药物化学和药理学驱动的，很大程度上依赖于长期经验积累。基于这一方法的筛选是耗时且盲目的，从中发现的药物靶标数目很少。

随着基因组测序取得突破，新技术使药物筛选速度大大加快，为医药领域开拓了更多机会。如今在基因组水平发现药物作用靶基因，已成为一个十分活跃的领域。

下一代测序 (NGS) 能够对人类群体的基因型-表型关系进行高通量分析，以遗传学为依据进行药物开发。NGS技术是继Sanger测序后的一项革命性进步，能够同时对百万条，甚至更多的DNA进行测序，并可实现在相对较低成本下对多基因、全外显子，甚至全基因组进行多种变异类型检测，且所需样本量和检测周期不会增加。

NGS在靶点发现中的应用主要有两种方式。对目标人群的基因测序可以同时揭示多种疾病或特征的表型特异性药物靶标(下图a) ；NGS可以鉴定定量表型极端值与罕见变异的关联，来识别特定表型的基因靶点(下图b) 。

▲ 图片来源：Drug Discovery Today

丹纳赫生命科学旗下Integrated DNA Technologies（简称“IDT”，中文名称“埃德特”）拥有文库制备、靶向捕获等NGS试剂能够帮助简化NGS 工作流程，并提高文库的覆盖度和复杂度，让每次实验都能获得可靠的结果。

cfDNA & FFPE DNA文库构建试剂盒提供快速简便灵活的文库构建工作流程，兼容 IDT 的定制接头套件和各类xGen靶向捕获产品

二代测序文库构建用接头（Adapter）创新设计搭配高灵活性的定制方案，全面适配illumina及MGI等测序平台

xGen基因组靶向捕获方案集捕获探针，封阻序列和洗脱试剂为一体，可以在包括高 GC 含量的困难基因组区域实现目标的高均一性覆盖

xGen全外显子捕获试剂盒高质量探针合成结合优化后的设计算法，进一步提高对全外显子组区域的覆盖以及测序的均一性和可重复性

▲ IDT ExomeResearch Panel试剂盒

此外， NGS实验流程中涉及很多移液步骤，高通量自动化的前处理方式能够加快实验流程，节省实验样本，减少人为误差，提高实验稳定性。贝克曼库尔特Biomek工作站能自动化完成DNA、RNA等多水平的NGS文库构建，帮助研发过程实现高通量、标准化、数据可追踪性和自动化。

▲ Biomek i7 自动化工作站

▲ 自动化及手工捕获效率比较

同时，Biomek工作站还能结合Echo声波移液处理工作站，进行纳升至微升的精准移液，Biomek+Echo可实现片段化、产物纯化、反应构建、杂交捕获、Pooling的全流程自动化，它可将NGS文库制备微量化缩小20倍，降低每次反应的试剂成本。单次样品处理通量可高至384个，完成384个样品Nextera XT试剂盒的文库制备工作仅需4小时。

▲ ECHO声波移液工作站

➤蛋白水平

人体所含蛋白质种类远远超过人类基因的数目，一个基因由于有不同的剪切方式可以同时编码几种或更多蛋白质，而且目前已知的药物靶点中，绝大多数为蛋白质。因此，从蛋白层面进行靶点的发现和验证，是药物开发的一个重要方向。

蛋白水平的靶标鉴定通常采用的策略是，比较疾病状态和正常生理状态下蛋白质的表达差异，从而寻找药物作用的靶标。不过，特定靶蛋白的发现和确定往往需要识别成千上万的蛋白质表达变化，是一个费时费力的过程。质谱技术已经成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。

丹纳赫生命科学旗下SCIEX公司拥有三重四极杆、三重四极杆复合线性离子阱以及高分辨质谱等，可用于蛋白组学靶点发现到验证的一系列工作。如，欧洲的一份关于COVID-19的研究，采集了180个早期感染SARS-CoV-2并入院的临床样本，采用贝克曼库尔特的自动化工作站进行样本前处理，SCIEX高分辨质谱TripleTOF 6600+进行蛋白组学的研究，确认了27种跟新冠肺炎严重程度等级相关的潜在生物标记物，为COVID-19治疗靶点的获得提供了研究依据。

▲ COVID-19感染严重程度相关蛋白组学研究Cell Syst. 2020 Jul 22; 11(1):11–24.e4.

另外，SCIEX最新推出的高分辨质谱ZenoTOF™ 7600系统采用了Zeno™ trap(Zeno阱)技术，克服了正交TOF技术在传统上占空比挑战，能够获得更多更有用的MS/MS信息，尤其对于低丰度离子，结合EAD或者CID碎裂，MS/MS灵敏度可提高5-20倍。在蛋白组学研究中，可以大大提高蛋白的鉴定个数。ZenoTOF™ 7600在DDA采集模式下，45分钟梯度，400ng K562细胞系能够鉴定到约3600个蛋白，1µg能够鉴定到约4000个蛋白。

▲ 高分辨质谱ZenoTOF™ 7600系统

▲ 微升流速下DDA蛋白鉴定数据

对于研究蛋白质空间组学，徕卡显微系统的Cell DIVE 超多标组织成像分析整体解决方案能够提供很大助力。这是基于抗体标记的超多标技术，可用于研究组织微环境中的空间细胞生物学结构和功能。Cell DIVE超多标组织成像整体解决方案包括拥有严格验证的350+抗体资源，采用专利保护的循环染色成像（染色-成像-漂白-再染色）方法，保证组织完整度的前提下，可针对一张切片中的超过60种蛋白进行分析。

▲ Cell DIVE 超多标组织成像分析技术

Cell DIVE能够建立和解析复杂的组织微环境（例如肿瘤异质性研究模型），进行药物筛选分析研究。其多重组织成像能力能够提供比单重技术更深入的分析，可以提高新生物标志物和靶标的发现率。

最近的一项研究利用Cell DIVE超多标组织成像分析整体解决方案探究了肿瘤细胞的异质性。为了寻找治疗肿瘤的合适药物，深入了解肿瘤微环境十分重要，特别是对生物标志物的空间位置的分析。

Cell DIVE通过结合基因组和磁共振成像(MRI)分析，使用43种标志性癌症生物标志物，揭示野生型弥漫性胶质瘤肿瘤和含有异酸脱氢酶(IDH)突变胶质瘤之间异质性的差异。Cell DIVE超多标组织成像分析整体解决方案的图像数据进行的空间分析和聚类分析显示在IDH突变肿瘤中标志性肿瘤蛋白的表达普遍低于野生型肿瘤。

▲ 脑胶质瘤研究的多模式数据生成和集成的工作流程（PLOS ONE. December 27, 2019）

➤细胞水平

传统的针对单一靶点的研究方法已经难以适应一些多基因疾病和病毒感染等相关治疗药物的研究。而基于细胞的高内涵筛选，通过使用高通量活细胞成像来筛选复杂细胞系统中的化合物，能够实现单细胞水平上对化合物多靶点多参数的同步检测。

高内涵意味着丰富的信息，可以获得包括单个细胞图像和各项指标、细胞群体的统计分析结果、细胞数量和形态的改变、亚细胞结构的变化、荧光信号随时间的变化、荧光信号空间分布的改变等各方面的信息。

高内涵筛选可从疾病相关基因调控通路和网络水平上研究药物的作用机制、代谢途径和潜在毒性等；同时，帮助深入了解化合物或亚细胞群复杂的相互作用，使在细胞水平全面评价活性化合物的成药性成为可能。

高内涵筛选克服了常规成像操作繁复、检测速度慢、数据分析复杂的缺点。通过有效结合了高速多通道共聚焦成像的检测技术及强大数据分析功能，高内涵细胞成像分析技术能够快速、批量、自动地捕获细胞、亚细胞或组织图像，并对细胞表型进行量化处理，批量实现图片信息到数值信息的转换，以及高通量图像信息的自动提取和分析。

Molecular Devices的ImageXpress Micro Confocal共聚焦高内涵成像分析系统适用于细胞生长、分化、迁移、凋亡等、蛋白表达、信号通路转导、血管生成、细胞周期、表型筛选、细胞毒性检测、3D 细胞球等高内涵成像分析。使用共聚焦成像进行厚样品拍摄能实现更低的背景和更高的锐利度，并由此产生更佳的图像分割。ImageXpress Micro 共聚焦高内涵成像系统针对活细胞或者固定细胞实验能提供更佳的定量分析能力。

▲ ImageXpress Micro Confocal共聚焦高内涵成像分析系统

如一项去势抵抗性前列腺癌药物筛选的研究中，构建了一种AR-TIF2位置生物传感器高含量筛选分析方法，该方法需要对图像呈现的表型可以1）发现能够诱导ARF2 PPI形成的新型激动剂2）筛选能阻断DHT诱导的AR-TIF2 PPI形成的化合物3）筛选能抑制AR跨膜转运的化合物。该方法使用MD的ImageXpressUltra系统和分析模块，对U-2 OS细胞中的AR-RFP和TIF2-GFP生物传感器的表达进行转位定量分析。通过计算TIF2-GFP阳性细胞核内的AF-RFP平均荧光强度来定量评估AR-TIF2的相互作用。

▲ ImageXpress处理的成对组合共感染的U-2 OS细胞的彩色合成图像

Methods Mol Biol. 2018;1683: 211–227.

对于影像学方法来说，徕卡显微系统的THUNDER 3D高内涵活细胞培养成像系统亦可进行高通量的药物靶点筛选。

▲ THUNDER Imager实验流程

THUNDER最大的特点是基于宽场成像，采用创新的Computational Clearing技术去除所有厚样本的宽场图像固有的焦外模糊信号。自动识别系统所有位置及光学参数，采用Decision Mask自动根据信噪比与当前光学参数抽出焦面信号。使 3D 样品在基于摄像头的荧光显微镜上依然能高质量地采图。

▲ 左至右：原始光信息--焦面信息--非焦面信息

在等效的方法中，流式细胞仪能够在单细胞水平上对多种化合物效应进行高内涵表征。流式细胞仪可以以每秒数百至数百万个细胞的速度，实现对细胞死活、周期、毒性、蛋白表达等多种快读高通量监测。

如流式细胞术能检测不同细胞亚群的胞内蛋白表达。淋巴亚群可以进行的实验包括胞内细胞因子表达和不同的细胞信号表达，从一般的磷酸酪氨酸到特定的磷酸化蛋白。目前最常用的研究T细胞功能的磷酸化蛋白主要是MAP激酶磷酸化合STAT蛋白磷酸化。这些实验对确定的细胞群体对药物作用的评估非常有用。

▲ 细胞内蛋白表达流式图

药物对于靶点的作用会通过信号通路网络的变化反应到细胞功能。而细胞的功能会通过活化或者分泌细胞因子的形式反应出来。流式可以准确的定量分析这些变化程度，进而评估药物对靶点的作用效果与作用程度。

▲ 流式细胞术检测细胞活化与功能分析

贝克曼库尔特本土创新的CytoFLEX系列流式细胞仪具有高达23个参数的设计，从单激光四色至六激光二十一色保证了优越的检测性能，并且符合FDA 21 CFR Part11要求。

▲ CytoFLEX流式细胞仪

配套的DuraClone预制干粉试剂可在常温下长时间保存，能够避免运输与储存不当造成的试剂失效以及减少不同试剂批次的差异。相关软件Cytobank借助机器学习算法，减少人工手动圈门主观误差，让数据分析也实现自动化、智能化，并且提供从原始数据分析到统计结果的一站式解决方案。面对大量的样本，还可以与自动化设备整合，实现自动化样本制备、处理及分析，减少操作误差，保证结果的稳定性和重复性。

▲ CytoFLEX流式细胞仪灵活的应对方案

药物靶点的筛选和验证是药物开发过程中一个重要环节，靶点筛选的成功与否直接影响到后期药物的相关研究。丹纳赫生命科学可以提供基因水平、蛋白水平、细胞水平的药物靶点发现及研究工具，提高靶点筛选效率，助力用户加快药物开发速度。