具有延迟开花期或抑制生长功能的多肽，编码所述多肽的多核苷酸及其用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102421793 A (43)申请公布日 2012.04.18 C N 1 0 2 4 2 1 7 9 3 A *CN102421793A* (21)申请号 201080017803.8 (22)申请日 2010.02.23 10-2009-0014883 2009.02.23 KR C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) A01H 1/00(2006.01) C12N 15/63(2006.01) (71)申请人浦项工科大学产学协力团 地址韩国庆尚北道 (72)发明人南洪基 朴景睦 李东熙 金正植 林平玉 (74)专利代理。

2、机构北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 11139 代理人孙皓晨 费碧华 (54) 发明名称 具有延迟开花期或抑制生长功能的多肽，编 码所述多肽的多核苷酸及其用途 (57) 摘要 本发明涉及一种具有延迟开花和/或抑制生 长功能的多肽，编码所述多肽的多核苷酸及其用 途。具体地讲，本发明涉及一种具有延迟开花和/ 或抑制生长功能的多肽，编码上述多肽的多核苷 酸，一种用于生产具有延迟开花表型的植物的方 法，一种用于生产具有生长受抑制的表型的植物 的方法，一种选择的转基因植物，一种用于筛选能 延迟植物开花或抑制生长的材料的方法。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.10.。

3、21 (86)PCT申请的申请数据 PCT/KR2010/001112 2010.02.23 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/095910 KO 2010.08.26 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 13 页 序列表 5 页 附图 7 页 CN 102421805 A 1/2页 2 1.一种在植物中具有延迟开花和/或抑制生长的功能的、选自下列一组的多肽： (a)具有SEQ ID NO：2所示完整的氨基酸序列的多肽； (b)包括SEQ ID NO：2所示氨基酸序列主要部分的多肽；和 (c)本质上类似于(a。

4、)或(b)的多肽。 2.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽本质上类似于(a)或(b)所述多肽，与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有80或以上的序列同源性。 3.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽本质上类似于(a)或(b)所述多肽，与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有90或以上的序列同源性。 4.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽本质上类似于(a)或(b)所述多肽，与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有95或以上的序列同源性。 5.一种编码权利要求1-4中任意一项所述多肽的多核苷酸。 6.一种选自下列一组的多核苷酸： (a)包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的一。

5、部分的多核苷酸；和 (b)本质上类似于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的一部分的多核苷酸。 7.将权利要求6所述多核苷酸用于鉴定或分离能够在植物体内诱导开花延迟和/或抑 制生长的基因的用途。 8.用于生产具有延迟开花和/或生长受抑制的表型的植物的方法，包括： (I)超量表达具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或类似于SEQ ID NO：1所示序列的核 苷酸序列的基因；和 (II)选择诱导了延迟开花和/或生长受抑制的表型的植物。 9.如权利要求8所述的方法，其中，所述核苷酸序列类似于SEQ ID NO：1所示序列，与 SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90或以上的序列同源性。 10。

6、.如权利要求8所述的方法，其中，所述超量表达步骤(I)包括将权利要求5所述多 核苷酸转化入植物体内。 11.如权利要求10所述的方法，其中，所述转化步骤包括(a)将编码权利要求5所述多 肽的多核苷酸插入包括调控核苷酸序列的表达载体，以便构建重组表达载体，和(b)将所 述重组载体导入宿主植物。 12.如权利要求10所述的方法，其中，所述转化步骤包括将权利要求5中编码所述多肽 的多核苷酸插入一种表达载体，以便构建重组表达载体，用所述重组表达载体转化农杆菌， 并且将转化后的农杆菌转染到植物体内。 13.如权利要求10所述的方法，其中，所述转化步骤包括用携带由SEQ ID NO：1所示 核苷酸序列组成。

7、的基因的重组载体转化农杆菌(Agrobacterium sp)，并且将转化后的农杆 菌转染到植物体内。 14.一种用于生产具有生长受抑制的表型的植物的方法，包括： (I)超量表达具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或类似于SEQ ID NO：1所示序列的核 苷酸序列的基因；和 (II)选择诱导了延迟开花和/或生长受抑制的表型的植物。 15.如权利要求14的方法，其中，所述核苷酸序列类似于SEQ ID NO：1所示序列，与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90或以上的序列同源性。 权 利 要 求 书CN 102421793 A CN 102421805 A 2/2页 3 16.如权利要。

8、求14的方法，其中，所述超量表达步骤(I)包括将权利要求5所述多核苷 酸转化入植物体内。 17.如权利要求14的方法，其中，所述转化步骤包括(a)将权利要求5中编码所述多肽 的多核苷酸插入包括调控核苷酸序列的表达载体，以便构建重组表达载体，和(b)将所述 重组载体导入宿主植物。 18.如权利要求14的方法，其中，所述转化步骤包括将权利要求5中编码所述多肽的多 核苷酸插入一种表达载体，以便构建重组表达载体，用所述重组表达载体转化农杆菌，并且 将转化过的农杆菌转染到植物体内。 19.如权利要求14的方法，其中，所述转化步骤包括用携带有由SEQ ID NO：1所示核 苷酸序列组成的基因的重组载体转化。

9、农杆菌，并且将转化过的农杆菌转染到植物体内。 20.一种选择转基因植物的方法，包括： (I)用一种携带目的基因，即权利要求5所述多核苷酸，和调控核苷酸的表达载体转化 植物，和 (II)鉴别已被诱导延迟开花和/或抑制生长的植物突变体。 21.如权利要求20所述的方法，其中，所述转化步骤(I)包括将所述表达载体转化入农 杆菌，并且将转化过的农杆菌转染到植物体内。 22.如权利要求20所述的方法，其中，所述转化步骤(I)包括用携带有由SEQ ID NO：1 所示核苷酸序列组成的基因的重组载体转化农杆菌，并且将转化过的农杆菌转染到植物体 内。 23.一种通过权利要求8-13中任意一项所述的方法生产的、。

10、表现出延迟开花表型的植 物。 24.一种通过权利要求14-19中任意一项所述的方法生产的、表现出生长受抑制的表 型的植物。 权 利 要 求 书CN 102421793 A CN 102421805 A 1/13页 4 具有延迟开花期或抑制生长功能的多肽， 编码所述多肽的 多核苷酸及其用途 技术领域 0001 本发明涉及一种调控赤霉素信号传导途径，能够延迟开花时间，并且抑制植物生 长的多肽，编码所述多肽的多核苷酸及其用途。 背景技术 0002 赤霉素，植物中存在的多种激素之一，最初是从真菌菌株藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)，一种导致水稻backanae病的病原体中分离的。。

11、 0003 在植物中，赤霉素(GA)与植物生长素相互作用，促进幼茎组织伸长，激活种子中 的-淀粉酶以便促进发芽，并且参与打破休眠。另外，GA可用于控制开花时间。例如，在 用GA处理时，可诱导需要低温或光周期的植物形成花蕾。具体地讲，即使植物没有授粉，GA 仍能促进坐果和果实生长。因此，在农业和花卉栽培中，GA被应用于各种植物，表现出多种 效果，包括，例如，对于秋大麦、桃、梨、苹果和葡萄，可取代低温作用而诱导开花，对于菊科 植物，可诱导花蕾形成，诱导夏菊、仙客来和樱草开花，诱导菠菜和烟草发芽，打破茄子、牛 蒡、萝卜和油菜的冬眠，以及生物合成淀粉酶，用于生产啤酒和麦芽。另外，在用GA的生物 合成抑。

12、制剂ancyumidol(A-Rest)或多效唑(Bonzi)处理时，植物会变小和变坚固，因此，它 们不容易被风暴吹落。 0004 最近，人们一直致力于在分子水平上研究GA的生理学现象。在这种研究的早 期阶段，分析了会导致绿色进化的矮化变体(降低高度的(rth)，dwarf-1(dl)，anther ear1(An1)-玉米；半矮生(sd-1)，Dwarf1，dl-qu；ls，le，na-菜豆)，或过渡生长的突变 体(la cry 3 -菜豆；procera(pro)-番茄；slender(sln)-大麦；SLN-菜豆)，以便加深有 关植物对GA应答的研究。2000年之后，随着这些基因被克隆(。

13、rth(Peng et al.，1999， Nature 400：256-261)，dl(Spray et al.，1996，PNAS 93：10515-10518)，an1(Bensen et al.，4995，Plant Cell 7：75-84)，sd-1(Sasaki et al.，2002，Nature 416：701-702)， dwarf1(Ashikari et al.，1999，PNAS 67：11638-11643)，el(Lester ea al，1997，Pl ant Cell 9：1435-1443)，na(Davidson et al，2003，Plant Phys。

14、iol.131：335-344)，参与GA 合成、识别和应答的基因开始被探明。这些研究通过分子学以及遗传学的方法在作为模型 的拟南芥上被进一步的系统性展开。 0005 特别是，大量筛选突变体对GA的应答(具有低GA应答的矮化突变体、用GA处理时 恢复成野生型的突变体、具有组成型GA应答的细长突变体)导致了参与GA合成的基因的 发现(GA1，GA4，GA5等)，参与GA的信号传导途径的基因的发现(杂合三聚体G蛋白，GAI， RGA，SPY，SLY等)以及参与GA应答的基因的发现(GA-MYB，-淀粉酶)。另外，最近在水 稻中发现的GA激素受体(GID1：Uefuchi-Tanaka et al.。

15、，2005，Nature 437：693-698)，极 大促进了对GA分子机理的理解。目前，人们继续致力于揭示这些基因之间的相互关系，以 便GA信号传导途径可以在分子水平上被综合性和系统性地理解(Schwechheimer et al.， 2008Curr.Opin.Plant Biol.，10：461-465)。 说 明 书CN 102421793 A CN 102421805 A 2/13页 5 0006 另外，已知GA在开花控制方面起着重要作用。拟南芥的开花时间是通过诸如光 照、温度、光周期等的外部信号和诸如养分、激素等的内部信号之间的相互作用调控的。具 体地讲，已知有四个途径调控开花期。

16、：光周期途径，自发途径，春化，和赤霉素(GA)途径 (Mouradov et al.，2002，Plant Cell，14：S111-130)。更具体地说，所述GA-缺陷型突变 体gal在单一条件下不会开花(Wilson et al.，1992，Plant Physiol.100：403-408)，因 此，GA被认为在单一条件下在控制开花时间方面发挥重要作用。GA调控开花时间的潜在 分子机制是激活目的基因，即开花促进因子1(FPF1)(Kania et al.，1997，Plant Cell 9： 1327-1337)，GA-MYB(Gocal，et al.，2001，Plant Physio。

17、l.，127：1682-1693)和SOC1(Moon et al.，2003，Plant J.，35：613-623)，以提高LFY的转录活性(Blazquez，et al.，1998， Plant Cell 10：791-800)。 0007 在作物育种中，调控成体大小和开花时间是非常重要的。在20世纪60年代 (1960s)的亚洲，生长调控导致了作物产量如此地大幅度提高，以至于由此带来了一场绿色 革命。另外，在欧洲，生长调节因子被用于预防植物受到风灾和低温的损害。因此，生长调 控与农产品的收成密切相关。另外，开花时间的调控使得能够在一年中的任何时间确定收 获时间，并且培育收获时间不依赖于。

18、环境因素的品种。为此，生物工程领域的研究人员在通 过遗传学的操作调控开花时间方面付出了巨大努力。 0008 本发明就是在上述背景下完成的。 发明内容 0009 技术问题 0010 因此，本发明的一个目的是提供一种具有延迟开花和/或抑制植物生长功能的多 肽。 0011 本发明的另一个目的是提供一种编码上述多肽的多核苷酸。 0012 本发明的另一个目的是提供一种用于生产具有延迟开花表型的植物的方法。 0013 本发明的另一个目的是提供一种用于生产具有生长受抑制表型的植物的方法。 0014 本发明的另一个目的是提供一种利用所述多核苷酸筛选转基因植物的方法。 0015 本发明的另一个目的是提供一种用于。

19、筛选延迟开花或生长抑制诱导子(inducer) 的方法。 0016 技术解决方案 0017 根据一个方面，本发明涉及一种在植物中具有延迟开花和/或抑制生长(矮化) 功能的多肽。 0018 正如在下面的例子中将要说明的，利用激活标记法(Weigel et al.，2000， Plant Physiology，122：1003-1013；该文献全文被收做本文参考)生产并且选择具有 延迟开花表型和/或生长受抑制表型的拟南芥(Arabidopsis thaliana)转化体。通过 TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced Polymerase Chain React。

20、ion；Liu et al.， 1995，Plant J.8：457-463；该文献全文被收做本文参考)克隆所述拟南芥转化体中负责延 迟开花和/或抑制生长的基因，并且确定为可编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的SEQ. ID.NO.1所示核苷酸序列。RNA凝胶印迹法也被用于确定所述延迟开花和/或生长受抑制 的表型是否是由所述基因的超量表达所致。最后，当携带所述基因的重组表达载体被导入 说 明 书CN 102421793 A CN 102421805 A 3/13页 6 其中时，发现这种拟南芥表现出与通过激活标记法生产的转基因植物有相同的延迟开花和 /或生长受抑制的表型。 0019 具体地。

21、讲，在植物中具有延迟开花和/或抑制生长功能的多肽是下列多肽之一： 0020 (a)具有SEQ.ID.NO.2所示完整的氨基酸序列的多肽； 0021 (b)包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列主要部分的多肽；和 0022 (c)本质上类似于(a)或(b)所述多肽的多肽。 0023 如以上所用的以及包括权利要求书在内的以下所有内容中，短语“诱导延迟开花 和/或抑制生长的功能”用于表示当本发明的基因(例如，具有SEQ ID NO：1所示核苷酸 序列的基因)超量表达时，导致所述延迟开花和/或受抑制的生长表型表达的功能。 0024 如以上所用的以及包括权利要求书在内的以下所有描述中，短语或术语“包括。

22、 SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列主要部分的多肽”，被定义为其所包含的SEQ.ID.NO.2所示氨 基酸序列多肽的部分，其长度足以使之仍保有与由SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列组成的多 肽相同的开花延迟和/或生长抑制所必须的功能。任何多肽，只要它保留了所述开花延迟 和/或生长抑制的必要功能，都满足本发明要求，而因此其长度或活度(例如，开花延迟和 /或生长抑制)并不重要。就是说，即使其活性低于SEQ.ID.NO.2完整多肽，只要具有延迟 开花和/或抑制生长的必要功能的任何多肽都可以包含在“包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸 序列主要部分的多肽”的范围内，而与其序列长度无关。本领域技术人。

23、员，即熟悉本发明相 关的现有技术的人员可以理解，包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列的多肽若缺失或添加突 变体，仍然可保留开花延迟和/或生长抑制功能。因此，包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序 列，但是删除了N-或C-末端区的多肽仍然是有功能的。本领域普遍接受的观点是，即使删 除了其N-末端区或C-末端区，突变体多肽仍然可保留完整多肽的功能。当然，如果删除的 N-或C-末端区相当于所述多肽功能所必须的基序，则所述删除的多肽就失去了完整多肽 的功能。不过，如何区分无活性多肽和活性多肽是本领域技术人员所熟知的。另外，缺少除 N-或C-末端区之外的某部分的突变体多肽仍然可保留完整多肽的功能。另。

24、外，本领域技 术人员可方便地验证这种缺失突变体是否仍然保留了完整多肽的功能。特别地，按照本发 明披露的SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，以及进一步经过 明确验证的当SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的基因超量表达时，所述转基因拟南芥表 现出延迟开花和/或生长受抑制的表型的例子，显而易见，本领域技术人员可以确定包括 SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列的多肽的缺失突变体是否仍然具备所述完整多肽的功能。因 此，在本发明中，必须理解的是“包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列主要部分的多肽”表示 可以由本领域技术人员根据本发明的方案制备的、保留了所述。

25、开花延迟或生长抑制功能的 任何缺失突变体。 0025 如以上所用的以及包括权利要求书在内的以下所有内容中，短语“本质上类似于 (a)或(b)所述多肽的多肽”，表示具有至少一个被替换的氨基酸残基、但仍然保留了SEQ. ID.NO.2所示完整氨基酸序列的功能，即开花延迟和/或生长抑制功能的突变体。类似地， 如果具有至少一个氨基酸残基被替换的突变体仍然表现出所述开花延迟和/或生长抑制 功能，其活性或替换百分比并不重要。换言之，无论突变体多肽的活性比包括SEQ.ID.NO.2 所示完整氨基酸序列的多肽低多少，或与包括SEQ.ID.NO.2所示完整氨基酸序列的多肽相 比，无论突变体多肽具有多少个被替换的。

26、氨基酸残基，只要它表现出所述开花延迟和/或 说 明 书CN 102421793 A CN 102421805 A 4/13页 7 生长抑制功能，所述突变体多肽仍然属于本发明的范畴。即使所述完整多肽的相应残基的 至少一个氨基酸残基被替换，如果所述替换的氨基酸残基与所述相应的残基在化学上等同 的话，所述突变体多肽仍然可保留完整多肽的功能。例如，当丙氨酸，一种疏水性氨基酸， 被类似的疏水性氨基酸，例如，甘氨酸，或被更疏水的氨基酸，例如，缬氨酸，亮氨酸或异亮 氨酸替换时，包括所述替换的氨基酸残基的多肽仍然保留了所述完整多肽的功能，即使它 (它们)具有较低的活性。类似地，由带负电荷的氨基酸，例如，谷氨酸。

27、和天冬氨酸之间的替 换形成的，包括替换的氨基酸残基的多肽，仍然可保留完整多肽的功能，即使具有较低的活 性。另外，该原则也适用于替换发生在带正电荷的氨基酸之间的突变体多肽。例如，包括赖 氨酸替换精氨酸的替换突变体多肽，仍然具有完整多肽的功能，即使其活性较低。另外，在 其N-或C-末端区包括替换的氨基酸的多肽仍然保留了完整多肽的功能。本领域技术人员 显而易见的是，现有技术可以制备保留了包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列的多肽的开花 延迟和/或生长抑制功能的、其中具有至少一替换代的氨基酸残基的突变体多肽。另外，本 领域技术人员可以确定替换突变体多肽是否仍然保留了完整多肽的功能。另外，因为本发 。

28、明披露了SEQ ID NO：1所示核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，并且提供了当由 SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的基因超量表达，或表现出开花延迟和/或生长抑制表 型的转基因拟南芥被明确验证的例子，显而易见的是，本领域技术人员可轻易地制备“本质 上类似于(a)或(b)所述多肽的多肽”。因此，“本质上类似于(a)或(b)所述多肽的多肽” 被理解成包括所有具有开花延迟或生长抑制功能的多肽，尽管其中存在至少一个替换的氨 基酸。 0026 尽管“本质上类似于(a)或(b)所述多肽的多肽”表示具有至少一个替换的氨基酸 残基，但仍然保留了所述开花延迟或生长抑制功能的任何突变体，从。

29、活性角度来看，与SEQ. ID.NO.2所示氨基酸序列具有更高同源性的多肽是更优选的。有用的多肽与所述野生型多 肽具有60或以上的同源性，最优选具有100的同源性。 0027 更具体地讲，更优选的序列同源性为60，61，62，63，64，65，66， 67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81， 82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96， 97，98，99和99.9，其优选度的增高顺序按数值升高的次序排列。99.9的序列同 源性说明在具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽上仅有一个氨基酸被替换。

30、。 0028 因为“本质上类似于(a)或(b)所述多肽”的多肽包括本质上类似于“包括 SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列主要部分的多肽”的多肽，并且本质上类似于“具有与SEQ. ID.NO.2完全一致的氨基酸序列的多肽”的多肽，以上说明同时适合本质上类似于“具有 SEQ.ID.NO.2所示完整的氨基酸序列的多肽”的多肽和本质上类似于“包括SEQ.ID.NO.2所 示氨基酸序列主要部分的多肽”的多肽两种情况。 0029 根据其另一方面，本发明涉及一种编码上述多肽的分离的多核苷酸。在本文中，术 语“上述多肽”意在不仅包括具有SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列的多肽，包括SEQ.ID.NO.2 。

31、所示氨基酸序列主要部分的多肽，和本质上类似于所述肽的多肽，在所述优选实施方案中， 还包括保留了所述开花延迟和/或生长抑制功能的所有多肽。因此，本发明的多核苷酸包 括编码具有开花延迟和/或生长抑制功能、并且保留了所述完整的SEQ.ID.NO.2所示氨基 酸序列或其氨基酸序列的主要部分的多肽的分离多核苷酸，和编码本质上类似于所述多肽 说 明 书CN 102421793 A CN 102421805 A 5/13页 8 的多肽的分离多核苷酸。另外，本发明的多核苷酸包括编码与SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序 列具有同源性的多肽的所有分离多核苷酸。如果揭示了一种氨基酸序列，本领域技术人员 即可根据氨基。

32、酸序列轻易地制备编码氨基酸序列的多核苷酸。 0030 从活性角度看，本发明的多核苷酸优选包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的一部 分。更优选的是包括SEQ ID NO：1所示完整的核苷酸序列。在本文中，短语“包括部分SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的多核苷酸”表示其序列长度足以在植物中确保延迟开花和/或 抑制生长功能的多核苷酸。只要它保留了具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的必要 功能，任何多肽都可以采用，即使其活性低于所述完整多肽，即所述具有SEQ ID NO：2所示 氨基酸序列的多肽。 0031 在本发明中，短语“分离的多核苷酸”在这里意在包括所有化学合成的多核苷酸、。

33、 从活体，特别是拟南芥中分离的多核苷酸、以及包括修饰过的核苷酸的多核苷酸，无论是单 链或双链RNA或DNA。因此，cDNAs、化学合成的多核苷酸、和从活体，特别是拟南芥中分离 的基因组DNAs，都属于“分离的多核苷酸”的范围。基于SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列，和 编码其氨基酸序列的SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列，以及本领域公知的技术，相应的cDNAs 和化学合成的多核苷酸的制备和gDNA的分离，可以由本领域技术人员轻易实现。 0032 根据其另一个方面，本发明涉及一种包括或本质上类似于部分SEQ.ID.NO.1所示 核苷酸序列的多核苷酸。在这里，短语“包括部分SEQ.ID.NO.。

34、1所示核苷酸序列的多核苷 酸”表示其序列长度足以鉴定和/或分离植物(具体如拟南芥)中具有开花延迟和/或生 长抑制功能的基因的多核苷酸。短语“本质上类似于部分SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列的 多核苷酸”表示与SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列相比，包括至少一个替换的核苷酸残基，并 且其序列依赖性结合能力足以在包括拟南芥在内的植物中鉴定和/或分离具有开花延迟 和/或生长抑制功能的基因。只要披露了SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列，本领域技术人员 可在此基础上轻易地实现在拟南芥或其他有机体中鉴定和/或分离具有开花延迟和/或生 长抑制功能的基因。因此，本发明的多核苷酸意在包括所有的其长度或序。

35、列依赖性结合能 力足以在包括拟南芥在内的植物中鉴定和/或分离具有开花延迟和/或生长抑制功能的基 因的多核苷酸，而与长度和与SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列的序列同源性无关。 0033 为了作为探针来验证未知基因是否具有与已知基因相同的核苷酸序列或用于分 离未知基因，一般已知这样的多核苷酸必须包括30个或更多推论的核苷酸残基。因此，本 发明的多核苷酸优选包括出自SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的30个或更多连续的核苷酸 残基。不过，出自SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的30个或更少推论的核苷酸残基组成的多 (或寡)肽仍然属于本发明的范畴。其原因是，如果它与部分SEQ.ID.NO.1所。

36、示核苷酸序列 具有100的同源性，所述多(或寡)核苷酸尽管短，但足以从拟南芥或其他生物中鉴定和 /或分离具有开花延迟和/或生长抑制功能的基因，并且所述鉴定和/或分离条件(缓冲液 pH，浓度等)是严格的。根据本文披露的本发明的内容，本领域技术人员可轻易构建和检测 长度为30个或更少碱基的多核苷酸，以便从拟南芥或其他生物中鉴定和/或分离具有开花 延迟和/或生长抑制功能的基因，并且可利用构建的多核苷酸，从拟南芥或其他生物中轻 易鉴定和/或分离具有开花延迟和/或生长抑制功能的基因。 0034 如以上所用以及包括权利要求书在内的所有以下描述中，术语“植物”意在包括 当其生物量减少时，能够产生对人类有益结。

37、果的所有植物。这种植物的最直接的例子包括 说 明 书CN 102421793 A CN 102421805 A 6/13页 9 抑制各种作物生长的杂草，盆栽植物，显花植物等。另外，为食用更简便，运输更方便等等 起见，食用植物也可归入被考虑植物的范围。更具体地讲，所述植物的例子包括生长在可 耕地上的杂草，盆栽植物如蔷薇、松树、瑞士五针松、竹子等，显花植物如剑兰、非洲菊、香 石竹、菊属、百合、郁金香等，谷类植物如水稻、小麦、大麦、玉米、菜豆、马铃薯、赤豆、燕麦、 粟等，蔬菜植物如拟南芥、大白菜、萝卜、胡椒、草莓、番茄、西瓜、黄瓜、甘蓝、香瓜、南瓜、大 葱、洋葱、胡萝卜等，经济作物如人参、烟草、棉花。

38、、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏、花生、加拿大油菜 (canola)，果实如苹果、梨、枣、桃、猕猴桃、葡萄、橘子、柿子、李子、杏、香蕉等，和饲料植物 如黑麦草、红三叶草、鸭茅、苜蓿、牛尾覃、多年生黑麦草，但不限于上述植物。 0035 另外，在本文中，术语“植物”必须被理解成不仅包括成体植物，还包括可发育成成 体植物的植物细胞、组织和种子。 0036 根据其再一个方面，本发明涉及一种用于生产具有延迟开花和/或生长受抑制表 型的植物的方法。 0037 术语“延迟开花”的所有语法形式和拼写方法变化均表示在提供相同的培养条件， 如温度、光照和黑暗时间周期等条件下，开花时间晚于野生型植物。 0038 术语“抑制。

39、生长”的所有语法形式和拼写方法变化均用于表示一种植物的生物量 低于其野生型的生物量，优选茎秆和/或叶片的生物量。在这里，生物量可以被理解为表示 植物器官如叶、茎等的重量、长度和/或大小。 0039 本发明用于生产具有延迟开花和/或生长受抑制的表型的植物的方法包括(I)超 量表达具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或类似于SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列的 基因，和(II)选择诱导了延迟开花和/或生长受抑制表型的植物。 0040 在本文中，术语“超量表达”的所有语法形式和拼写方法变化均表示在提供相同 的培养条件，如温度，光照和黑暗时间周期等时，基因的表达水平高于野生型植物的表达水 。

40、平。 0041 在本文中，短语“具有类似于SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列的基因”用于 表示SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的基因的同系物，包括虽然根据不同的进化途径形成了 各种植物物种从而具有不同核苷酸的序列、但却保留了开花延迟和/或生长抑制功能的所 有基因。更优选与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有更高同源性的基因。当然，100的 序列同源性是最优选的。与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的同源性的下限，优选为60。 更具体地讲，更优选的序列同源性为60，61，62，63，64，65，66，67，68， 69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79。

41、，80，81，82，83， 84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98and 99，其优选度增高的顺序按数值增高的次序排列。 0042 具有类似于SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列的基因的另一个优选例子是因为 密码子简并产生的基因的功能性等同物。所述基因的功能性等同物包括编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸。 0043 在本发明的方法中，所述超量表达步骤(I)优选包括将编码本发明多肽的多核苷 酸转化入植物体内。 0044 在本文中，术语“转化”的所有语法形式和拼法变化，均表示无论采用何种方法将 外源多核苷酸(编码一种。

42、具有诱导开花延迟和/或生长抑制的功能的多肽)导入宿主植 说 明 书CN 102421793 A CN 102421805 A 7/13页 10 物，更准确地讲导入植物细胞，导致所述宿主植物发生遗传学改变。一旦导入宿主植物， 所述外源多核苷酸可整合到所述宿主植物的基因组中或者是独立的，本发明包括这两种情 形。 0045 用外源多核苷酸转化植物可以通过本领域公知的典型方法实现(Methods of Enzymology，Vol.153，1987，Wu and Grossman ed.，Academic Press)。 0046 为了进行转化，可将外源多核苷酸插入载体，如质粒或病毒，它们被用作将所 。

43、述外源多核苷酸携带到植物体内的运输工具。另外，所述重组载体可被转化入农杆菌 (Agrobacterium bacteria)，它被用作将DNA输送到植物体内的介体(Chilton et al.， 1977，Cell 11：263：271)。另外，外源多核苷酸也可直接导入植物体内(Lorz et al.，1985， Mol.Genet.199：178-182)。 0047 一个广泛使用的植物转化方法是将获得了外源多核苷酸的根瘤农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)转染到小植株，植物细胞或种子中。本领域技术人员可以将 其培养并且使所述转染的植物细胞或种子生长成成熟的有机体。。

44、 0048 所述转化步骤优选通过下述优选方式实现：(a)将编码本发明多肽的多核苷酸以 可操作地连接方式插入包括调控核苷酸序列的表达载体，以便构建重组表达载体，和(b) 将所述重组载体导入宿主植物，以便提供转基因植物。 0049 优选的是，所述转化步骤包括将编码本发明多肽的多核苷酸以可操作地连接方式 插入包括调控核苷酸序列的表达载体，以便构建重组表达载体，用所述重组表达载体转化 农杆菌(Agrobacterium sp.)，并且将转化的农杆菌转染到植物体内。更优选的是，所述转 化的农杆菌是转化的根瘤农杆菌。 0050 术语“调控核苷酸序列”必须被理解成包括对所研究的基因表达有影响的所有序 列。调。

45、控核苷酸序列的例子包括前导序列、增强子、启动子、起始密码子、终止密码子、复制 起点、核糖体结合位点等。 0051 在本文中，术语“可操作地连接”或“被可操作地连接”，用于表示调控序列与其他 核苷酸序列功能性连接，以便调控该核苷酸序列的转录和/或翻译。例如，如果启动子影响 位于该载体上所研究的基因转录，该基因就是可操作地连接的。 0052 作为可用于本发明的启动子序列，它们可以是诱导型或组成型。组成型启动子的 例子包括CaMV启动子，CsVMV启动子，和Nos启动子。诱导型启动子(启动子的活性是通 过诱导物诱导的，以便表达可操作地连接的基因)的例子包括酵母-铜金属硫蛋白启动 子(Mett et 。

46、al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，90：4567，1993)，取代的苯磺酰胺诱导型 In2-1和In2-2启动子(Hershey et al.，Plant Mol.Biol.，17：679，1991)，糖皮质激素响 应因子(GRE)(Schena et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，88：10421，1991)，乙醇-诱 导型启动子(Caddick et al.，Nature Biotech.，16：177，1998)，来自核酮糖-1，5-二磷酸 羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的光-诱导型启动子(Coruzzi et al.，EM。

47、BO J.，3：1671，1984； Broglie et al.，Science，224：838，1984)，manopine合成酶启动子(Velten et al.，EMBO J.，3：2723，1984)，胭脂碱合成酶(NOS)and章鱼碱合成酶(OCS)启动子，和热休克启动子 (Gurley et al.，Mol.Cell.Biol.，6：559，1986；Severin et al.，Plant Mol.Biol.，15： 827，1990)。 0053 重组载体可具有选择性标记基因。在本文中，术语“标记基因”用于表示编码可用 说 明 书CN 102421793 A CN 10242。

48、1805 A 8/13页 11 于选择包含该基因的植物或植物细胞的特征的基因。标记基因可以是抗生素抗性或除草剂 抗性的。可用于本发明的选择性标记基因的例子包括腺甙脱氨酶基因、二氢叶酸还原酶基 因、潮霉素-B-磷酸转移酶基因、胸苷激酶基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和草铵膦 乙酰基转移酶基因。 0054 在本发明的实施方案中，将由SEQ ID NO.1的碱基序列组成的基因插入表达载体 pCambia1302，以便构建重组载体pCambia1302-SIL1，再将该重组载体转化入根瘤农杆菌， 然后将转化的根瘤农杆菌转染到拟南芥体内。 0055 在考虑本发明的实施方案时，所述转化步骤优选包括用由S。

49、EQ ID NO.1的碱基序 列组成的基因，更优选用包括所述基因的重组载体，特别是pCambia1302-SIL1转化植物， 最优选将携带pCambia1302-SIL1的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转染到植 物体内。 0056 所述选择步骤(II)可以通过以下方式实现：在生长步骤(I)的转基因或转化植物 之后，用肉眼或利用同时导入所述植物体内的选择性标记基因选择植物。 0057 根据其又一个方面，本发明涉及通过本发明的方法生产的具有延迟开花和/或生 长受抑制表型的植物。本发明的植物被理解成包括转基因植物，其中，延迟开花和/或生长 受抑制的表型是通过具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或具有类似于SEQ ID NO：1所示序 列的核苷酸序列的基因超量表达诱导的。 0058 根据其又一个方面，本发明涉及一种利用上述本发明的多核苷酸。