【现学现卖】绿色荧光蛋白1

Expression of thegreen fluorescent protein-encoding gene from a tobacco mosaic virus-basedvector(Casper andHolt, 1996)绿色荧光蛋白在烟草花叶病毒载体上的表达

摘要

含有GFP的cDNA片段连接在TMV基因组cDNA克隆上，用其体外转录的侵染性RNA转录本侵染烟草叶片。1-2天后，可以在接种叶片和整株植物中观察到绿色荧光。通过持续的观察发现病毒系统性侵染（systemic infection）是通过两种移动侵染方式造成的，一个是缓慢的通过病毒在细胞与细胞之间扩增（水平），另一个是快速的植物叶脉介导的病毒的传播（竖直）。

综述

病毒在侵染植物中的检测和定位有多种方法，比如Tissue printing（利用病毒特异性抗体在植物不同组织部分中检测病毒存在），或者利用标记了的核苷酸探针等。

得益于体外转录生成侵染性RNA的新技术（【现学现卖】构建具有侵染性的病毒克隆），我们可以通过改造RNA病毒的cDNA克隆，加入报告基因。之前有人将大肠杆菌中的β-glucuronidase-encoding gene (gus)在植物病毒克隆中表达，实现了在植物中的精确定位。然而上述报告基因的检测需要采样，停止侵染，而GFP可以进行非破坏性检测。

烟草花叶病毒tobacco mosaic virus（TMV）为单链RNA，基因组6.4kb，编码RdRP（或称replicase，以RNA为模板的RNA聚合酶，用于病毒复制）；移动蛋白MP（movement protein，细胞间扩散的必需蛋白）；和外壳蛋白CP（coatprotein，包裹RNA，也是保证病毒在植物中扩散的必要组分）。其中MP和CP在亚基因组（subgenomic）mRNA的3‘端转录。

操作

基础质粒p4GD-PL包含设计好的TMV基因组，将PCR扩增的0.7kb的GFP-ORF构建在基础质粒的MCS区域，产生了构建好的载体，并命名为p4GD-GFP。示意图如图：

利用p4GD-GFP体外转录的侵染性4GD-GFP转录本侵染烟草叶片，大约24h后可以在荧光显微镜下观察到荧光。接种点在40h观察时是很亮的1mm直径的圆，以1mm/d的速度增加。当扩散区域碰到叶脉后会快速沿着叶脉传播，2mm/d。然而在韧皮部（phloem）或木质部（xylem）感染的组织看不到GFP表达。

讨论

之前还做了试验，用GFP替换CP，但是发现病毒的快速扩散被抑制，原来CP对于病毒的传播还是有必要的。且在植物根中也可以检测到病毒的荧光，再一次印证了之前关于TMV可以在植物根部积累的研究。

GFP在病毒中表达稳定，侵染1-2周后仍可以看到荧光。并且试验中没有观察到细胞坏死，说明GFP对植物细胞没有毒性。

参考文献

Casper, S.J., and Holt, C.A.(1996) Expression of the green fluorescent protein-encoding gene from a tobaccomosaic virus-based vector. Gene 173: 69-73.