猪瘟病毒与宿主天然免疫系统的相互作用

猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)中的一员[1]。由其感染猪和野猪引起的猪瘟(Classical swine fever，CSF)是以出血综合征和免疫抑制为特征的烈性、高度接触性传染病，被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)列为必须报告的疫病[2]。CSFV传播速度快、致死率高，可感染各个年龄阶段的猪，而且在多个国家流行，严重影响世界养猪业的健康发展，造成极大的经济损失。目前，接种猪瘟疫苗是预防猪瘟的主要手段。猪瘟兔化弱毒疫苗在我国防控猪瘟工作中起到了很好的作用，但当下猪瘟的感染主要以持续性感染的方式存在，加上当前使用的疫苗保护效力等诸多问题，都给猪瘟的防控与净化带来了困难与新的挑战[2-3]。

宿主天然免疫系统在机体抗病毒感染过程中发挥着重要作用，是机体抵抗病原体入侵的第一道防线。另一方面，病毒也会进化出多种高效抑制免疫功能的策略来拮抗宿主的抗病毒反应[4-7]。CSFV感染宿主后，宿主可通过启动一系列的天然免疫应答来抵抗CSFV的感染。然而，CSFV是典型的免疫抑制性病毒，可通过多种途径抑制宿主的天然免疫信号通路，以维持自身对宿主的持续感染。近年来，随着研究者们不断地深入研究，CSFV感染与宿主天然免疫系统的关系被逐渐揭示。本文着重总结猪瘟病毒感染与天然免疫应答及其免疫抑制机理的研究进展，希望能为猪瘟的防控提供参考。

CSFV完整的病毒粒子形态呈球形，表面有6 nm-8 nm类似穗样的突起，直径介于30 nm-50 nm之间。病毒外部包裹着脂蛋白双层囊膜，内部是对称的二十面体结构的核衣壳[8]。CSFV核衣壳内含有全长约12.3 kb的单股正链RNA，RNA两端分别是不具有甲基化帽子结构的5′-UTR和不具有poly (A)尾巴结构的3′-UTR，中间是一个大的开放阅读框，编码一个含有3 898个氨基酸的多聚蛋白。多聚蛋白在宿主细胞内被特异性蛋白酶剪切成4种结构蛋白(C、Erns、E1、E2)和8种非结构蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。5′-UTR和3′-UTR参与启动CSFV基因组的转录、调控蛋白的翻译及复制过程；而CSFV的各个蛋白则调控CSFV的吸附、复制、组装和释放等环节[9-12]。

根据对5′-UTR、E2及NS5B的核苷酸差异分析，将全球流行的CSFV分为3个基因群(1、2、3群)和10个基因亚群(1.1、1.2、1.3、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3、3.4亚群)[13]，2013年Postel等在古巴发现了第11个亚群——1.4基因亚群[14]。1群主要分布在欧洲、亚洲及美洲地区；2群主要分布在欧洲和亚洲地区，除了南非和以色列分别在2005年和2009年报道有2.1基因亚群CSFV的暴发外，非洲和中东地区对猪瘟流行的报道较少[15-16]；3群主要分布在亚洲[17]。中国大陆流行的CSFV毒株为1.1、2.1、2.2、2.3基因亚群，中国台湾为3.4基因亚群。此分类方法与病毒毒力无直接联系，市面上使用的猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)和石门强毒株都属于1.1基因亚群[2, 18]。

天然免疫系统是机体抗病原体感染的第一道防线，在抵抗病原体入侵的同时还能建立起与获得性免疫反应的桥梁。病原体入侵机体后，病原相关模式分子(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)会被宿主相应的模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)识别，从而激活天然免疫信号通路。模式识别受体主要包括Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)、RIG-I样受体(RIG-I like receptors，RLRs)和Nod样受体(Nod like receptors，NLRs)[6, 19-21]。这些受体介导的天然免疫信号通路被激活后，使转录因子3 (Interferon regulatory factor 3，IRF3)、IRF7、NF-κB (Nuclear factor-kappa B，NF-κB)等活化，后者调控各种干扰素(Interferon，IFN)和炎症因子的表达。产生的IFN等细胞因子与相应的受体结合，激活Janus酪氨酸激酶-信号转导子和转录活化子(Janus tyrosine kinases-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)信号通路，启动一系列干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs)的表达，从而起到抗病原体的作用[22-24]。现已报道有许多动物病原体感染可以诱导宿主抗病毒天然免疫应答[6, 25]。CSFV是典型的能引起免疫抑制的病毒，它与宿主天然免疫应答是互相博弈的过程：CSFV感染能诱导宿主的天然免疫应答，而CSFV又能通过多种途径抑制宿主的天然免疫，从而实现其对宿主的持续感染。近年来，虽然对CSFV与宿主天然免疫系统相互作用的研究不断深入，但是其机制仍不完全清楚，因此，关于此方面的研究方兴未艾。

TLRs作为一类识别PAMP的重要受体，在天然免疫系统中扮演着重要的角色。TLRs在多种细胞中都有表达，哺乳动物中目前被发现的TLRs有13种(TLR1-13)，能够识别病原微生物脂多糖、核酸等成分[26-27]。CSFV感染猪后，其主要对巨噬细胞和血管内皮细胞有亲嗜性。Borca等研究发现，CSFV Brescia株感染猪外周血单核细胞(PBMCs)后，对TLRs (TLR3、5、9、10)、Ⅰ型干扰素、炎症因子IL-1α、IL-1β、IL-6等的表达水平有影响[28]。同样，通过基因芯片技术检测CSFV石门株感染PBMCs后天然免疫相关基因的表达情况，发现TLR2、TLR4、IRF3、IRF7和TBK1等转录水平均出现差异表达[29]。进一步研究发现，CSFV石门株感染PBMCs后，能够通过激活TLR2、TLR4、TLR7，启动MyD88依赖的信号转导通路，使IRF7及细胞外信号调节激酶(Extracellular regulated kinase1/2，ERK1/2)活化，从而引起炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10及Ⅰ型干扰素的表达[30]。有报道显示，在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中，IL-1β的上调与作为离子通道蛋白影响病毒毒力的CSFV p7蛋白有关[31]。在浆细胞样树突状细胞(PDCs)中，CSFV不依赖病毒粒子而激活TLR7信号通路，诱导IFN-α的分泌[32]，这一现象与丙型肝炎病毒(HCV)的相关研究结果相似[33]。此外，Moriyama等研究表明，HCV的非结构蛋白中，只有NS5B蛋白能利用其RNA依赖的RNA聚合酶活性来激活TLR3介导的天然免疫应答，从而诱导IFN-β的表达[34]。

TLR介导的信号转导通路中重要的接头蛋白MyD88，能够激活转录因子NF-κB和有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的信号通路，从而诱导炎症因子及Ⅰ型干扰素的表达[35]。Bensaude等研究发现，CSFV Alfort 187株感染猪血管内皮细胞能激活NF-κB，引起IL-6和IL-8的表达，使猪发生出血综合征[36]。也有研究表明，宿主硫氧还蛋白2 (Thioredoxin 2，Trx2)通过参与激活NF-κB信号通路从而抑制CSFV的复制；然而，CSFV E2蛋白却能与Trx2相互作用，降低Trx2的表达，抑制NF-κB信号通路的激活[37]，并且CSFV E2蛋白能通过与MEK2相互作用抑制JAK-STAT信号通路，促进CSFV复制[38]。

RLRs家族主要包括视黄酸诱导基因I (Retinoic acid-inducible gene I，RIG-I)表达蛋白、黑色素瘤分化相关蛋白5 (Melanoma differentiation-associated protein 5，MDA5)、遗传学和生理学实验室蛋白2 (Laboratory of genetics and physiology 2，LGP2)，它们在宿主天然免疫中发挥至关重要的作用[6, 39-40]。CSFV石门株感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)后，能被RIG-I、MDA5受体识别，招募接头分子IPS-1，激活转录因子IRF3及NF-κB，诱导Ⅰ型干扰素及炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的产生，抵抗CSFV的感染[41]。不同的是，2′, 5′-寡腺苷酸合成酶L (2′, 5′-Oligoadenylate synthase-like protein, OASL)发挥抗CSFV的作用不是依赖于经典的OAS/RNase L信号通路，而是通过其与MDA5受体相互作用来诱导IFN-β的表达，从而达到抵抗CSFV的目的[42]。此外，CSFV感染过表达和干扰宿主血红蛋白β亚基的PK-15细胞系的实验表明，宿主血红蛋白β亚基能够抑制CSFV的复制。该研究发现宿主血红蛋白β亚基能与RIG-I受体相互作用来上调IFN-β的表达，从而达到拮抗CSFV增殖的目的[43]。

干扰素抗病毒功能是通过诱导一系列具有抗病毒活性的ISGs以抵抗病毒的感染和复制，实现保护宿主的目的[22]。目前已报道了许多具有抗病毒活性的ISGs，主要包括双链RNA依赖的蛋白质激酶(PKR)、粘病毒抗性基因(Mx)、2′, 5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)、干扰素刺激基因15 (ISG15)、干扰素诱导跨膜蛋白(IFITM)等[5, 44-45]。有研究表明，CSFV感染PBMCs后，利用基因芯片技术筛选出许多转录差异的ISGs，如Mx1、OAS1、ISG15、ISG20、ISG60、IFIH1等[29, 46-47]，进一步研究表明，GBP1、GBP2、ZNF313、OASL、OAS1、CD47、Mx1等能显著抑制CSFV的复制[48]，说明ISGs在抗CSFV感染过程中发挥重要作用。

由干扰素诱导产生的GTPase家族具有水解酶活性，将GTP水解成GDP和GMP。其包含4个亚家族：VLIG蛋白、Mx家族蛋白、与免疫相关的GTPase (IRGs)和鸟苷酸结合蛋白(GBPs)，均具有防御病原体感染的功能[49-50]。有研究表明，无论在体内还是体外，CSFV石门株感染宿主后都能使GBP1的表达水平上升。GBP1是通过其GTPase活性来显著降低CSFV的IRES翻译效率，以抑制CSFV的早期复制。然而，CSFV NS5A蛋白能与GBP1相互作用来抑制GBP1的抗病毒功能[48]。还有研究表明，过表达GBP1后其GTPase活性也能显著抑制HCV的增殖[51]。此外，Pan等对登革热病毒(DENV)的研究表明，GBP1是通过影响NF-κB的活化来促进IFN-β、IL-6的表达，从而拮抗DENV的复制[52]。

作为GTPase家族一员的Mx蛋白，在CSFV感染中同样发挥了抗CSFV的功能。有实验揭示了CSFV能抑制猪内源性Mx1蛋白的产生，然而在CSFV感染过表达猪源Mx1的PK-15细胞系中检测到CSFV的增殖明显下降，并且用原核表达纯化的猪源Mx1处理感染CSFV的PK-15细胞发现，CSFV的增殖呈剂量依赖性降低[53]。此外，Zhao等研究表明，在人源Mx1转基因猪中，CSFV的复制也明显受到抑制[54]。以上结果说明人源和猪源的Mx1蛋白都能够抑制CSFV的复制。

PKR是具有RNA依赖的Ser/Thr蛋白激酶活性的ISG[55]。CSFV感染PK-15细胞会使PKR和eIF2α发生磷酸化。通过CSFV感染过表达和干扰PKR的PK-15细胞系发现，PKR能够促进CSFV的复制。进一步研究表明，在CSFV感染干扰PKR的PK-15细胞系中，IFN-β的表达水平上调，从而上调Mx1蛋白的表达[56]。这些结果提示，CSFV利用PKR/eIF2α信号通路来逃避宿主的免疫应答。猪源OAS蛋白家族包括：OASL、OAS1和OAS2。有报道认为猪OASL、OAS1都能显著抑制CSFV的复制，且OASL与MDA5受体存在相互作用，激活由MDA5受体介导的Ⅰ型干扰素信号通路，上调IFN-β的转录水平来抑制CSFV的增殖，从而达到抵抗CSFV的目的[42, 48]。

CSFV是一种典型的免疫抑制性病毒，免疫器官的损伤是其引起机体免疫抑制的根本原因。临床上主要表现为B淋巴细胞、细胞毒性T细胞和辅助性T细胞等的减少、淋巴器官与骨髓的病理损伤。深入研究发现，淋巴细胞的减少与细胞凋亡密切相关[57-58]。另外，研究证实CSFV能中和机体内的特异性抗体，从而使机体的体液免疫应答受到抑制[59]。由于免疫抑制的存在，使猪的免疫力低下，造成多病原体混合感染猪群，从而使各种疾病复杂化，给诊断和疫病防控带来困难。

已知许多病毒可以通过抑制宿主的天然免疫功能以利于自身的感染与复制[25, 60]，而作为典型的能引起免疫抑制的CSFV在此方面的现象尤为明显。Cao等研究表明，CSFV石门株能显著抑制TLR3介导的天然免疫应答[30]；而由CSFV Alfort 187株弱化而来的CSFV Thiveral弱毒株无论在体内还是体外，都能抑制NF-κB信号通路，这可能是由于IκBα未被降解所致[61]；Bensaude等对CSFV Alfort 187株持续感染猪血管内皮细胞的研究表明，其可以通过抑制细胞凋亡和Ⅰ型干扰素的分泌来实现对细胞的持续感染[36]。IL-10是病毒持续感染的必要条件[62]。CSFV石门株感染PBMCs后，上调IL-10的表达，结果显示IL-10与CSFV的持续感染密切相关[30]。在对CSFV感染过表达和干扰MEK2及PKR的PK-15细胞系的研究中发现，MEK2及PKR能促进CSFV的复制[38]。另外，有研究表明，CSFV可使巨噬细胞内的一氧化氮水平降低而抑制巨噬细胞的抗病毒免疫应答[63]。自噬与机体免疫系统之间的关系错综复杂，其在病毒感染过程中发挥了重要作用。有研究表明，CSFV能够诱导PK-15细胞以及3D4/2细胞发生自噬，借助自噬小体逃避宿主的免疫反应，促进自身复制，使病毒实现持续感染[64]。综上可知，CSFV能够通过多种途径抑制或调控天然免疫系统，从而突破宿主的第一道防御体系，实现对宿主的持续感染，并使宿主对其它病原易感。

病毒感染宿主后，病毒蛋白会通过许多途径调控宿主的诸多生物学过程，以利于病毒复制及其在宿主内的存活。CSFV感染猪后，宿主的天然免疫应答受到CSFV蛋白的调控，引起宿主天然免疫抑制，从而有利于CSFV持续感染与复制(表 1)。

Chen等实验证明，CSFV的吸附受体是层粘连蛋白受体(Laminin R)，而CSFV Erns蛋白与Lam R存在相互作用，可增强CSFV对宿主的感染[66]。CSFV Erns蛋白还具有免疫抑制作用，是造成猪瘟持续感染的重要结构蛋白。例如，CSFV Erns蛋白能与外源的dsRNA结合，拮抗外源dsRNA诱导的IFN-β表达，揭示了CSFV Erns蛋白能抑制宿主的天然免疫应答[67]。同样，对与CSFV同属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) Erns蛋白的相关研究表明，Erns蛋白能随循环系统到达其它部位，由于Erns蛋白具有核酸内切酶活性，在pH中性条件下可降解细胞外病毒ssRNA或dsRNA，阻止了细胞外病毒ssRNA或dsRNA诱导的Ⅰ型干扰素的分泌，进而抑制宿主的抗病毒反应，有利于BVDV感染宿主[79-80]；而且CSFV E2蛋白又能与Trx2相互作用，降低Trx2的表达，抑制NF-κB信号通路的激活[37]。另外，CSFV的Erns蛋白能促进宿主T淋巴细胞凋亡，抑制机体特异性免疫反应[81]。

CSFV NS2基因编码457个氨基酸，具有自消化蛋白酶的活性[12, 17]。有研究表明，CSFV NS2蛋白在猪脐静脉内皮细胞(SUVECs)中稳定表达后可以诱导细胞内质网应激及NF-κB的活化，从而上调IL-8和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，表明NS2蛋白在CSFV感染中能够诱导炎症反应和抵抗细胞凋亡，这有利于CSFV在宿主细胞中持续感染[74]。另外，NS2蛋白还能上调细胞周期蛋白A的转录水平，从而导致细胞周期停滞在S期，表明CSFV可以通过NS2蛋白来调控细胞生长周期，以适应病毒增殖[75]。CSFV NS3蛋白具有丝氨酸蛋白酶、解旋酶及核苷水解酶的活性[12, 17]。最新研究表明，CSFV NS3蛋白能够与宿主细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TRAF6)相互作用，促进病毒复制并有助于病毒实现持续感染。TRAF6能够促进NF-κB的活化而使IFN-β和IL-6表达量增加。但是CSFV NS3蛋白通过降解TRAF6，致使NF-κB的活性受到抑制，从而促进CSFV的增殖[76]。

CSFV NS5A蛋白不仅可以刺激病毒多聚蛋白的装配，而且能抑制病毒基因组的转录和翻译，这可能是CSFV能持续感染宿主的原因之一；而CSFV NS5B蛋白是最大的非结构蛋白，具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，是CSFV基因组的复制酶[17]。有研究证实，CSFV NS5A蛋白能抑制由Poly(I:C)诱导的NF-κB信号通路，下调炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的转录水平[77]，说明CSFV NS5A蛋白也具有拮抗宿主天然免疫的功能。通过免疫共沉淀和GST pulldown实验证明，CSFV NS5A蛋白能与GBP1的GTPase活性结构域相互作用，抑制GBP1的GTPase活性，达到削弱GBP1抵抗CSFV感染的目的，而CSFV NS5B蛋白并无此功能[48]。但是，有研究表明，HCV NS5B蛋白能通过与GBP1相互作用抑制GBP1的GTPase活性，以利于HCV的复制[51]。有趣的是，HCV NS5B蛋白能激活TLR3介导的天然免疫应答，而HCV NS4A、NS4B和NS5A却抑制了NS5B诱导的天然免疫应答，使之持续感染宿主[34]。此外，CSFV NS5A蛋白能通过诱导宿主细胞发生自噬来促进CSFV的增殖和在宿主细胞中的成熟，这可能与CSFV逃避宿主天然免疫有关[64]。

CSFV与宿主天然免疫系统的相互作用过程错综复杂。一方面，CSFV感染宿主后，Toll样受体和RIG-I样受体介导的天然免疫信号通路能被激活，进而诱导GBP1、OASL等ISGs表达，以抵抗CSFV的感染。另一方面，CSFV能够通过多种途径抑制或调控天然免疫系统，从而逃避宿主的第一道防御屏障。特别是几种CSFV蛋白可通过调控宿主的天然免疫信号通路来拮抗宿主的天然免疫，如CSFV C蛋白与宿主血红蛋白β亚基相互作用、Erns蛋白与外源dsRNA结合以及Npro等非结构蛋白与宿主的一些蛋白相互作用均能不同程度地抑制宿主天然免疫应答，这不仅造成了CSFV的持续感染，而且可诱发其它病原的混合感染，给养猪业带来巨大的经济损失。

对CSFV与宿主天然免疫系统相互作用的深入研究，有助于研究者们了解宿主抗CSFV的机理，认识CSFV如何逃避宿主天然免疫防御体系。近年来，虽然这方面的研究已经取得了一定进展，但宿主抗CSFV天然免疫应答的调控网络还未完全阐明。一方面，目前已知CSFV C、Erns、Npro、NS3、NS5A等蛋白均具有抑制宿主天然免疫应答的功能，但是病毒蛋白之间是否存在协同作用，是否还有其它病毒蛋白可抑制宿主的抗病毒应答？另一方面，CSFV基因组是单股正链RNA，其与宿主天然免疫系统之间是否存在相互作用，哪个区域能调节宿主天然免疫系统都尚未完全清晰，有待进一步的研究。宿主核酸，如长链非编码RNA (lncRNA)等RNA分子如何参与CSFV与宿主天然免疫系统的相互作用过程仍不清楚，需系统探究。此外，已报道宿主细胞中的有些因子能被CSFV利用以利于病毒逃避宿主天然免疫应答，可以深入探究这类宿主因子，以期为开发新型抗CSFV药物提供新的思路和对策。