PEDv感染的免疫应答及预防感染研究

本研究的目的是评估猪感染PEDV产生的体液和细胞免疫反应，并评估它们在防止再感染方面的作用。三周龄的猪主动感染了PEDV，并研究了它们对该病毒的免疫反应。在感染后30天(dpi)，感染PEDV的猪随后进行PEDV田间分离毒株攻毒，以研究先前感染PEDV产生的免疫反应的有效性。

#3 材料与方法

猪只和饲养

3周龄PEDV血清阴性杂交仔猪来自一个没有PEDV感染史的商业农场。猪只们被安置在明尼苏达大学的隔离设施里。到达后，在明尼苏达大学兽医诊断实验室通过实时逆转录聚合酶链反应(rRT-PCR)对从猪身上收集的肛拭子样本检测PEDV、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)。每天监测两次实验猪只的不良反应。

细胞和病毒

病毒从澄清后的细胞培养上清液通过20%（w/v）蔗糖密度梯度超速离心法纯化。简而言之，PEDV培养上清感染Vero76细胞的培养上清液通过3000xg离心澄清30minoC来清除细胞碎片。澄清培养上清液覆盖在20%缓冲蔗糖梯度层上，在112,600xg，4˚C下离心2小时。沉淀重新悬浮在无菌PBS中，并在-80 ˚C分装储存。未感染Vero76细胞的培养上清经过类似处理用做空白对照抗原。作为ELISA中的抗原，纯化的病毒通过60oC在水浴中浸泡1小时灭活。根据制造商说明书，使用Pierce™BCA蛋白分析试剂盒（Thermo Fisher）测定热灭活的病毒的总蛋白浓度。

猪只感染PEDV

3周龄仔猪(n=12)通过胃内途径接种感染了PEDV USA/Colorado/2013毒株的猪只肠粘膜刮液。每头猪接种了10mL病毒液，含有3.6×104 TCID50/ml的感染剂量。在感染后4、7、10和21天采集血液，在感染后4、10和21天采集肠组织和肠系膜淋巴结，以评估免疫反应。

猪接触PEDV和攻毒

为了研究之前接触PEDV是否能防止再次感染，低生物安全饲养室内的三周龄猪(n=10)通过直接接触正在饲养PEDV感染猪只的员工，方法如前所述。简单而言之，在动物感染房，研究人员与通过胃内接种途径感染PEDV的猪进行直接互动。在与受感染猪互动45分钟后，工作人员不脱下个人防护设备(PPE)的情况下进入低生物安全饲养室，并在低生物安全饲养室与猪互动45分钟，以便将PEDV病毒传播到低生物安全室的猪。每天重复这个程序，直到低生物安全室的所有猪检测出PEDV呈阳性。每天收集直肠拭子样本，以评估病毒的排毒。在感染后30天，低生物安全室中PEDV接触感染猪被随机分为2组（每组n=5），并安置在两个独立的房间中。一组PEDV接触感染猪通过口服途径攻毒，毒株来自PEDV临床急性感染猪只的肠道粘膜刮液，另一组PEDV接触感染猪只不攻毒。使用定量RT-PCR分析，证实粘膜接种物具有高PEDV滴度。第三组对照组，日龄匹配猪（n=4）接受相同PEDV毒株攻毒，将攻毒猪只与那些先前接触病毒的猪只进行比较。

直肠拭子样本

每天使用棉签样本（BD）进行直肠样本的采样。每个拭子都被悬浮在2mlDMEM，含有2%BSA、1%抗生素抗粘菌、0.15%TPC胰蛋白酶和0.1%庆大霉素，储存在-80˚C，用50μl的该悬浮液提取RNA。

肠内均质物

收集回肠的近端部分，并用不含钙和镁的汉斯平衡盐溶液(HBSS)漂洗。在测量重量后，大约1g组织切割成小块，使用MagNA Lyser（罗氏）以5000rpm离心30秒，重复三次，获得匀浆。小肠匀浆在10000xg 在4˚C离心10分钟，上清液用于RNA提取和ELISA。

PEDV定量实时RT-PCR

通过实时RT-PCR来量化直肠拭子和肠道均质中的PEDV RNA水平。使用MagMAX96病毒RNA分离试剂盒从50μl的样本中提取RNA™（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）使用说明。通过计算OD260/280的比率来评估RNA的纯度。PEDVS基因的一部分被以下引物对扩增病毒RNA水平被标准化为1g肠道组织。

PEDV中和试验

用免疫蚀斑法测定猪血清和肠道匀浆中的PEDV中和抗体滴度50%蚀斑减少中和滴度（PRNT50)用大于50%中和活性的血清最高稀释度的倒数来表示。

流式细胞术

采用流式细胞法测定了外周血单核细胞(PBMC)和肠系膜淋巴结中B淋巴细胞和T淋巴细胞亚群的比例。

统计学分析

结果以平均值±标准误的形式表示。采用带有韦尔奇校正的单向方差分析(anova)来确定各自数据之间的差异是否显著。“p”小于0.05的值被认为很显著。使用Prism7软件（GraphPad）进行统计分析。

#4 试验结果

之前接触PEDV可防止再次攻毒后的排毒

只有50%接触USA/Colorado/2013毒株PEDV的猪表现出轻微和短暂腹泻的迹象。然而，在通过RT-qPCR检查直肠拭子样本时，在所有接触PEDV猪都检测到病毒RNA(图1)。更早可在接触PEDV后的第3天的粪便中检测到PEDV RNA，被感染的猪继续排毒直至感染后26天。未感染猪的粪便拭子样本的PEDV RNA呈阴性。接触PEDV后28天，直肠拭子样本未检测到PEDV RNA。为了确定之前接触病毒是否可以保护猪免受再次感染，随机选择的一组接触PEDV猪在感染后30天口服PEDV攻毒。攻毒1天后，对照组（未接触PEDV）的所有直肠拭子中检测到病毒RNA。相比之下，先前接触PEDV的所有猪的直肠拭子样本中未检测到PEDV RNA，这表明PEDV感染猪可以阻止其后攻毒的排毒。

图1.之前接触PEDV可防止随后感染的排毒。三周龄仔猪通过与饲养感染猪只的工作人员亲密接触实现PEDV感染。在接触感染30天时，接触PEDV的猪接受田间分离毒株的攻毒（EC组）或未攻毒（E组）。作为对照，年龄匹配的未接触PEDV病毒的猪接受攻毒（NC组）。通过直肠拭子样本的RT-qPCR测定病毒排毒情况。（每组中的n=3到5）。Dpi-感染后天数；dpc-攻毒后天数。

肠道PEDV RNA检测

对感染后4、10和21天的制备的肠道匀浆用RT-qPCR检测肠道组织中的病毒RNA载量。以上时间点都检测到PEDV病毒RNA，其中感染后4天出现病毒RNA峰值(图2A)。到感染后10天，肠道中的病毒RNA水平显著降低了4个log级，到感染后21天出现最低的病毒载量。

附图2. 肠道病毒RNA RT-qPCR测定结果。(A) 三周龄猪通过胃内途径接种PEDV。在指定的感染后天数下采集肠道组织，以分析病毒RNA水平。(B)三周龄仔猪通过与饲养感染PEDV猪只的工作人员亲密接触实现PEDV感染。在感染后30天时，用PEDV田间分离株攻毒。作为对照，日龄匹配仔猪受到相同分离株病毒的攻毒。攻毒后5天收获组织进行分析。病毒RNA水平被标准化为1克肠道组织。N：空白对照；NC：攻毒对照；E：仅感染PEDV不攻毒；EC：感染PEDV后攻毒。**p