基于细胞热漂移测定(CETSA)技术鉴定活细胞内药物靶标的标准操作流程

在新药研发过程中，靶标的筛选和鉴定是限制药物使用和药物副作用认知的主要因素。传统的蛋白和药物相互作用研究往往采用体外纯化的蛋白质，但是蛋白在纯化过程中其构象可能发生改变，所获得的药物-靶标相互作用信息不能反映活细胞内的真实情况[1]。另外，细胞生化代谢的复杂性导致药物在人体内的靶标可能并非唯一，并且在穿越细胞膜屏障时，药物自身可能被修饰或者活化。因此，在细胞层面正确识别靶蛋白，全方位解析药物的副作用，对药物设计和应用至关重要。

2013年瑞典卡罗琳斯卡(Karolinska)研究所开发了一种可以在体内检测药物与靶标结合强度的方法，即细胞热漂移测定(cell thermal shift assay, CETSA)技术[2-3]。CETSA技术从体外热漂移测定(thermal shift assays, TSA)发展而来。TSA是基于蛋白质随着温度增加而逐渐变性的原理，来表征蛋白质结构的技术。执行特定功能的蛋白质在细胞内具有稳定的三维结构，但随着环境的改变，比如pH值或者温度，蛋白的变性或解折叠就会迅速发生。对蛋白质而言，随着温度升高，部分蛋白会逐渐变性沉淀，当温度升高到某个值时，变性的蛋白质和未变性的蛋白质的数量相等，此时的温度称为熔解温度(melting point, Tm)[4]。当温度超过Tm时，变性蛋白的数量大于未变性蛋白的数量，蛋白聚集呈指数增加，直至全部蛋白质分子变性聚集而沉淀。Tm作为蛋白质结构稳定性的指标之一，其值越高，蛋白质构象的热稳定性就越高。Tm与溶液的pH值、盐浓度以及蛋白的翻译后修饰等有关，同时，配体的结合也会稳定蛋白质构象，从而使蛋白质的Tm值升高[5]。TSA技术广泛应用于检测药物与蛋白质在体外的相互作用，以及体外筛选特定蛋白的候选药物等[6]。

虽然CETSA技术和TSA技术原理相同，即基于蛋白质热变性原理，但CETSA技术是一种在活细胞水平(培养细胞、活体组织等)鉴定靶标的新方法[2]，可检测细胞中可溶性蛋白的总量。加热处理细胞时，随着温度的升高，蛋白质逐渐变性沉淀，有活性的可溶性蛋白量逐渐减少，通过生化分析手段如蛋白印迹杂交(Western blotting)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)等就能够绘制出特定蛋白的可溶性蛋白含量随温度变化的曲线，即熔解曲线[7]。对特定蛋白而言，可溶性蛋白量与变性蛋白量相等时的温度，或者可溶性蛋白量占总蛋白量一半时的温度，称为聚集温度(aggregation temperature)，等同于熔解温度(Tm)[7]。当细胞经药物处理后，药物和靶蛋白结合，使靶蛋白的热稳定性增强，Tm值增加，根据药物处理前后Tm的变化情况，就可以确定靶蛋白和药物在生理水平上是否有相互作用。在CETSA测定中，蛋白质与药物化合物的反应是在蛋白质保持正确的亚细胞定位、翻译后修饰、代谢物反馈等条件下进行的，是一种更加可信的药物靶标筛选方法[3, 8]。同时，CETSA方法还能评估在恒定温度下，随着配体浓度增加，靶标蛋白质可溶性蛋白量的变化，绘制等温剂量反应曲线，计算药物的有效浓度，为药物的临床使用提供参考，为不同患者间的药效比较提供依据[9]。

Western blotting是通过特异性抗体对靶蛋白进行检测的技术。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质按分子量大小进行分离后，再将蛋白转移到杂交膜上，通过抗原和抗体的特异性反应鉴定蛋白质，判断表达水平，以及亚细胞定位等。Western blotting技术因其操作简便、特异性强、灵敏度高等被广泛用于蛋白检测。

本研究以针对多发性骨髓瘤的靶向药帕比司他(panobinostat)为例，采用CETSA和Western blotting相结合的技术，在活细胞水平检测panobinostat的靶蛋白。我们详细介绍了该方法的标准操作流程，讨论了实验过程中的注意事项和此方法的应用局限，希望该方法能够为广大科研人员、药物研发公司和药物的临床使用提供借鉴和帮助。

本研究使用的试剂主要为小分子化合物(靶向药)、细胞培养基、Western blotting杂交用抗体等，具体信息见表 1。

本研究使用的仪器及相关耗材主要为加热处理细胞的PCR仪、分离可溶性蛋白的电泳仪、Western blotting杂交的转膜仪、成像仪等，具体见表 2。

基于Western blotting的CETSA实验流程包括：药物处理细胞、加热细胞以变性和沉淀蛋白、细胞裂解、离心或者过滤去除细胞碎片和变性聚集体(蛋白沉淀)、收集可溶性蛋白、可溶性蛋白的凝胶电泳和Western blotting定量检测(图 1)。可溶性靶蛋白经Western blotting确证后，将蛋白条带的定量结果进行曲线拟合，得到可溶性靶蛋白含量随着温度变化的熔解曲线(药物浓度保持不变，温度改变的拟合曲线，图 1A)、药物处理前后的Tm值(图 1A)、等温剂量反应曲线(isothermal dose-reponse fingerprint, ITDRF) (温度保持不变，药物浓度改变的拟合曲线，图 1B)，以及可溶性靶蛋白浓度为总浓度一半时的药物浓度值(EC50) (图 1B)。此实验流程可在任何生物化学和分子生物学实验室进行。

根据药物研究方向选择合适的样本，如细胞系、动物组织器官、离体组织器官或者病人血清等。本研究中采用的小分子靶向药为panobinostat，选择的样本材料为K562细胞系，其中含有和panobinostat相互作用的靶蛋白——组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC1)、人突触蛋白(human syntaxin-4, STX4)以及四三肽重复结构域(tetratricopeptide repeat domain 38, TTC38)[7]。这些材料不仅需要足够的数量，还要具备一定的细胞密度或者组织新鲜度，才能保证实验的重复性和准确性。

在药物穿过细胞膜进入细胞内发挥作用时，有些化合物会被修饰或者被降解，从而失去与靶标蛋白结合的能力，因此需要摸索合适的处理时间以减少药物的衍生化反应；许多药物都具有较高的脂溶性，需要用有机溶剂溶解，例如二甲基亚砜(DMSO)，但有机溶剂影响细胞的存活率以及靶蛋白与药物的亲和力，因此，需要优化配体药物的使用浓度；最后，药物处理后的细胞、组织等需要及时清洗，避免药物的表面黏附，减少药物的非特异性结合。

由于细胞、组织和血清等材料对温度变化的敏感性不同，而不同靶标蛋白的熔解温度也存在差异，因此有必要在对细胞进行药物处理前，优化加热处理的温度范围，确保感兴趣蛋白质的Tm在熔解曲线的中间位置。在加热处理细胞的过程中，还应对样品体积、细胞密度和加热时间等参数进行优化。

根据药物的作用机制，靶标可能是可溶性蛋白或者膜蛋白。可以采用反复冻融或者液氮研磨等方法得到可溶性蛋白。在提取膜蛋白时，需要加入表面活性剂并摸索表面活性剂的种类和用量，以达到降低蛋白变性，同时不影响提取效率的目的。

细胞或者组织裂解后，可以通过离心或者过滤的方式去除提取液中的蛋白聚集体和细胞碎片。离心法快速简单，但蛋白沉淀物的去除不彻底，可采用超离心技术，尽可能去除杂质，降低变性蛋白的干扰。在条件允许的情况下，可以用0.45 μmol/L亲水性聚偏二氟乙烯转印膜(PVDF)材质的过滤器过滤去除杂质，该技术得到的可溶性蛋白杂质少、背景低。

在本研究中，采用抗靶蛋白的抗体进行Western blotting实验。抗体的质量至关重要，纯度高、特异性强的抗体杂交得到的结果为单一蛋白条带。如果是自制的多克隆抗体血清，最好用盐析、离子交换、亲和层析等方法进一步分离纯化后再使用。

本实验操作流程除CETSA熔解曲线(图 1A)外，还能获得一定温度条件下，药物浓度依赖的剂量反应曲线(图 1B)。具体的温度选择原则是：在该温度下，经药物处理的细胞中，总可溶性蛋白含量与对照组相比有显著差别。为了降低药物对细胞的损害，选择某特定温度时，要同时兼顾尽可能低的药物使用量。卡罗琳斯卡研究所的研究者们选用略大于Tm值的温度进行等温剂量反应实验[2]。

使用低浓度靶向药panobinostat处理K562细胞系，检测10个不同温度下(37–67 ℃)可溶性蛋白的含量水平。以panobinostat的溶剂DMSO处理细胞作为阴性对照。实验过程见图 1A，具体实验步骤如下。

细胞培养和化合物处理(6–7 h)：

(1) 将含有1 mL K562细胞悬液的冻存管在37 ℃水浴中迅速解冻，加入5 mL DMEM+10% FCS培养基混合均匀。300×g离心5 min，弃去上清液，用1 mL培养基重悬细胞后加入到含9 mL培养基的10 cm培养皿中，在37 ℃、5% CO2浓度的二氧化碳培养箱培养2 d。

(2) 显微镜下检查细胞密度，如果细胞密度达80%–90%，即可进行传代培养。

(3) 收集细胞，300×g离心5 min，弃去上清液，用3 mL培养液重悬混匀细胞，将细胞悬液按1:9的比例添加到新的含9 mL培养基的10 cm培养皿中，在37 ℃、5% CO2浓度的二氧化碳培养箱培养2 d；共3皿细胞。

(4) 显微镜下检查细胞密度，如果细胞密度达80%–90%，继续传代培养。

(5) 收集细胞，300×g离心5 min，弃去上清液，分别用3 mL培养液重悬混匀细胞，将细胞悬液按1:9的比例添加到新的含9 mL培养基的10 cm培养皿中，在37 ℃、5% CO2浓度的二氧化碳培养箱培养2 d；可传代9皿细胞。

(6) 显微镜下检查细胞密度，按照10 cm培养皿可收获的细胞量13.7×106计算，即细胞密度为1.4×106个/mL。

需要注意的是，精确的细胞密度应该用血球计数板计数。取上述细胞悬液稀释至合适倍数，按1:1的比例加入0.4%溴酚蓝染液，反应3–5 min后滴加到血球计数板和盖玻片之间，低倍镜(10×10倍)下观察计数，分别计9个大方格中4角大方格的细胞数目。计数时，只计没有被溴酚蓝染色的活细胞，不计蓝色死细胞。一般计下线细胞不计上线细胞，计左线细胞不计右线细胞，若细胞聚成一团则按一个细胞进行计数。按照每毫升细胞悬液细胞数等于4角大格细胞总数的平均值乘以10 000计算细胞数目，最终的细胞数要乘以稀释倍数。

(7) 分别转移24 mL培养液至2个T75培养瓶，共48 mL。

(8) 加120 µL/0.2 mmol/L的panobinostat (panobinostat母液浓度是10 mmol/L，使用前用DMSO稀释至0.2 mmol/L)至一个T75培养瓶，终浓度为1 µmol/L；加120 µL DMSO溶剂至另一个T75培养瓶作为阴性对照。

需要注意的是，DMSO或者其他有机溶剂对细胞生长会有一定的损伤，在正式实验前应该先做有机溶剂耐受性的预实验，使用细胞量开始减少的最高有机溶剂用量，一般情况下DMSO的浓度不超过1% (体积分数)。药物使用浓度和反应时间也需要经过预实验确定。

(9) 在37 ℃、5% CO2浓度的二氧化碳培养箱反应5 h。

(10) 将细胞反应液分别转移到2个50 mL离心管中。

(11) 室温，300×g离心5 min得细胞沉淀。

(12) 沉淀用20 mL PBS洗2次，300×g离心5 min。

(13) 用0.8 mL含蛋白酶抑制剂的冰预冷PBS重悬细胞沉淀。

(14) 各取80 µL分装至10个0.2 mL PCR管(约3.4×106个/管)，panobinostat和DMSO各10个温度(37–67 ℃)，共20管。

细胞悬液的热处理(10 min)：

(15) PCR仪设置6个温度点(37、41、44、47、50、53 ℃)，将PCR管放入PCR仪加热3 min，立即取出室温放置3 min，液氮冷冻样品(处理过程中温度和反应时间一定要保持恒定)。

(16) PCR仪设置4个温度点(56、59、63、67 ℃)，将PCR管放入PCR仪加热3 min，立即取出室温放置3 min，液氮冷冻样品。

(17) 样品可在–80 ℃放置过夜。

需要注意的是，不同厂家、不同型号PCR仪能够设置的温度点不同，如果PCR仪中能一次性处理10个温度点，实验可一次性操作完成。本实验使用的PCR仪单次最多能设置6个符合要求的温度点，因此样品分2次处理。

(18) 细胞裂解(1 h)。

细胞在液氮和设置为25 ℃的加热模块间反复冻融2次，每次解冻后，振荡混匀。裂解后的细胞放冰上。

(19) 振荡混匀，转移细胞裂解物到1.5 mL离心管，4 ℃、20 000×g离心20 min，离心后样品放在冰上。

(20) 小心取70 µL可溶性蛋白上清液，转移至新的1.5 mL离心管，冰上放置，最多放1–2 h。

(21) Western blotting (5–6 h or 1–2 d)。

取40 µL样品加10 µL 5×SDS上样缓冲液[250 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)；10% SDS (质量体积分数)；0.5%溴酚蓝(质量体积分数)；50%甘油(体积分数)；500 mmol/L DTT]，70 ℃加热10 min。

(22) 4 ℃、20 000×g离心20 min，取上清。

(23) 组装4%–12% Bis-Tris蛋白预制胶，加Tris-MOPS-SDS电泳缓冲液(50 mmol/L Tris, 50 mmol/L MOPS, 0.1% SDS, 1 mmol/L EDTA, pH 7.7)。

(24) 取15 µL可溶性蛋白样品(约2.0× 105 cells)上样，按照温度从低到高的顺序上样。

(25) 120 V电泳1.5 h。

(26) 电泳完成后取出凝胶，并在托盘中用去离子水短暂冲洗凝胶。

(27) 按照滤纸、甲醇活化的PVDF膜、凝胶和滤纸的顺序组装半干转膜三明治层，按照3倍膜面积计算电流量，恒流模式转膜，转膜30 min。

(28) 取出PVDF膜，并将膜转移至装有TBST缓冲液[20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5–7.6)；150 mmol/L NaCl；0.05% Tween 20]的容器或托盘中，清洗10 min。

(29) 室温下用封闭缓冲液(含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液)封闭1 h，或4 ℃封闭过夜。

(30) 按照1:5 000的比例用TBST缓冲液稀释HDAC1一抗或者其他抗体，取PVDF膜至一抗稀释液孵育1 h，或4 ℃孵育过夜。

(31) TBST缓冲液洗膜，每次10 min。

(32) 按照1:7 500的比例用TBST缓冲液稀释HRP-conjugated IgG二抗，室温孵育1 h。

(33) TBST缓冲液洗膜，每次10 min (可以增加清洗时间和次数以减少背景)。

(34) 在干净塑料纸上加100 µL ECL底物反应A液和100 µL ECL底物反应B液，混匀，用干净的镊子将膜放置在反应液上，再盖一张干净塑料纸将反应液压均匀，确保溶液均匀覆盖整个膜，室温孵育5 min。

(35) 用Fusion Fx成像仪曝光成像，选择合适的化学发光通路和曝光时间，获取一系列图像。

(36) 用Image J软件量化处理不同抗体显色得到的特异性蛋白条带：在Image J中打开图片，转化为8-bit的灰度图；消除背景后选择合适的像素值；用矩形选框工具选择第一个特异性条带；复制矩形选框选择第2个特异性条带，重复该步骤直到选择所有条带；下拉Analyze选项的Gels，点击Plot Lanes，显示条带的灰度曲线图；用直线工具将所有10个小峰的峰值封闭；选择魔法棒工具，依次点击封闭后的各个小峰，即可得到峰面积，也就是对应条带的灰度值；将数值导入Excel表进行数据分析，每组最低温度特异性条带的显色强度设为100%，其他条带显色强度与此相比获得不同温度点的相对强度值。

(37) 通过GraphPad Prism软件绘制以温度尺度为横坐标、特异性条带相对强度为纵坐标的函数曲线，以此表示靶标蛋白可溶性蛋白量随温度变化的趋势，称为表观熔解曲线。用Boltzmann Sigmoid[10]等式计算熔解温度Tm。

对于等温剂量反应实验，除了是在恒温条件下加不同浓度的药物外，其他反应流程与表观熔解曲线实验一致(图 1B)。本研究采用的温度是55 ℃，panobinostat浓度从10 µmol/L逐渐降低至0.000 15 µmol/L，以溶剂DMSO为阴性对照。

细胞培养和化合物处理(6–7 h)：

(1) K562细胞用DMEM+10% FCS培养基培养至1.4×106/mL，共培养25 mL。

(2) 转移2.5 mL (约3.5×106 cells)至6孔细胞培养板，从1–10做好标记。

需要注意的是，6孔细胞培养板的底面积是9.6 cm2，最适细胞接种体积是2.5 mL，最少可收获的细胞量是2.5×106 cells。

(3) 加60 μL 2 mmol/L的panobinostat至第1个0.2 mL PCR管，加45 μL DMSO到2–10个PCR管，从1–10做好标记。

(4) 按15 μL的体积序列稀释药物，混匀7次，稀释到第9孔即可，第10孔为DMSO。

(5) 取22 μL稀释好的化合物至新的0.2 mL PCR管，–20 ℃保存备用。

(6) 取12.5 μL稀释好的化合物至对应标记的6孔细胞培养板中，混匀(不同孔化合物浓度分别为10、2.5、0.625、0.156 25、0.039 06、0.009 77、0.002 44、0.000 61、0.000 15 µmol/L和DMSO vehicle)。

(7) 在37 ℃、5% CO2浓度的二氧化碳培养箱反应5 h。

(8) 将细胞反应液分别转移到10个15 mL离心管中。

(9) 室温，300×g离心5 min得细胞沉淀。

(10) 沉淀用20 mL PBS洗2次，300×g离心5 min。

(11) 100 µL含蛋白酶抑制剂的冰预冷PBS重悬细胞沉淀。

(12) 重悬液转移至10个0.2 mL PCR管(约3.5×106 cells/管)；

(13) 4 ℃、300×g离心3 min，小心取出20 µL上清液，轻轻将剩余80 µL细胞弹起，4 ℃放置备用。

细胞悬液的热处理(10 min)：

(14) PCR仪设置成55 ℃，将PCR管放入PCR仪加热3 min，立即取出室温放置3 min，液氮冷冻样品。

(15) 样品可在–80 ℃放置过夜。

细胞裂解和Western blotting步骤同2.3.1。

Panobinostat是组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的广谱抑制剂，本研究选取药物panobinostat最具代表性的细胞内靶蛋白HDAC1，建立基于CETSA方法的细胞内靶标鉴定的标准操作流程。药物处理前后的表观熔解曲线如图 2A左图所示，HDAC1的特异性杂交图谱如图 2A右图所示。结果表明，随着温度的升高，HDAC1的特异性条带强度逐渐降低，由于panobinostat对靶蛋白的稳定作用，加药处理后熔解曲线显著右移。利用Boltzmann Sigmoid等式计算Tm值，加药前为39.82 ℃，加药后为63.33 ℃。

为了提供更具说服力的证据，还挑选了另外2个已证明是panobinostat作用位点的靶蛋白人突触蛋白(human syntaxin-4, STX4)和四三肽重复结构域(tetratricopeptide repeat domain 38, TTC38)[7]。结果如图 2B–2C所示，药物处理后STX4和TTC38表观熔解曲线显著右移，表明这2个蛋白在药物作用下稳定性增强，相同温度条件下可溶性蛋白量增加。加药前后STX4的Tm值分别是49.17 ℃和57.13 ℃，TTC38的Tm值分别是47.10 ℃和53.56 ℃。

与HDAC1的ΔTm值相比，STX4和TTC38的ΔTm偏移值跨度较小，造成这种差异的原因可能是蛋白本身的性质，或者结合强弱，也有可能是同一蛋白几种不同形式的折叠中间体与配体结合的综合性结果[3, 11]。同时，ΔTm值不能反映配体与靶标的亲和力大小，这是因为在细胞环境中，蛋白的可溶性和聚集变性是一个动态过程，产生Tm位移的蛋白折叠焓和热容量变化与配体浓度没有确定的相关性。靶标和配体结合的亲和力大小需要通过体外的TSA或者其他实验确定。

以看家基因β-actin作为阴性对照，药物处理前后可溶性蛋白含量随温度变化的波动幅度在理论上应该一致，但本研究中β-actin的Tm值在药物处理前后也有小范围变化，分别为52.27 ℃和56.83 ℃ (图 2D)。这可能是实验过程中细胞密度的微小变化、细胞裂解后可溶性蛋白的提取效率，以及Western blotting的转膜效率等操作误差造成的。因此，建议用等温剂量曲线再次验证靶标和药物配体的结合。

Western blotting结果显示，随着药物浓度的增加，HDAC1、STX4和TTC38的可溶性蛋白量逐渐增多(图 3)，根据该拟合曲线计算可溶性靶蛋白浓度为总浓度一半时的药物浓度值(EC50值)，HDAC1为0.932 70 nmol/L，STX4为258.60 nmol/L，TTC38为18.43 nmol/L。等温剂量反应曲线的确定进一步证明这3个蛋白是panobinostat的直接靶标。β-actin可溶性蛋白含量杂交结果显示，随着配体浓度的增加β-actin条带强度没有显著变化，表明β-actin的确不是panobinostat的作用位点。

以上结果显示，55 ℃的热处理温度比较适合这3个蛋白的鉴定，在此温度条件下，未加药物处理时HDAC1、STX4和TTC38蛋白主要处于部分变性和沉淀的状态，但随着药物浓度增加至饱和水平时，靶蛋白被药物稳定，蛋白可溶性部分就会增加。等温剂量反应中温度的选择至关重要，不能太高，以避免错过一些弱相互作用的靶点；也不能太低，从而导致药物稳定样品前后可溶性蛋白的表达量没有统计学差异。

本文建立了以Western blotting定量检测为判定手段的CETSA方法标准操作流程，该方法对药物的已知靶标或感兴趣靶标具有直观且准确的鉴定和确证能力。Western blotting入门级别低，是分子生物学实验室蛋白检测的常规操作手段，以Western blotting检测为起点，大大降低了药物靶标筛选的难度和对仪器的依赖程度。同时，Western blotting检测可以为将来建立基于定量质谱及蛋白组学的CETSA方法摸索条件[7]，如药物浓度、细胞处理量、细胞处理时间和温度、细胞体积、蛋白提取方法等，这样可以极大提高制备样品的质量，减少后期仪器使用费用。

Western blotting印记杂交很少产生假阳性结果，但是包括复合体在内的大蛋白对热漂移的敏感性较低，容易出现假阴性结果。另外，如果被修饰蛋白、水解蛋白或者变构蛋白是药物的正确靶标，而该蛋白抗体不识别这些抗原决定簇，也会造成假阴性结果。更为重要的是，基于Western blotting的CETSA方法只能鉴定或者确证少数已知的靶蛋白，不适合大规模的靶标筛选。因此，迫切需要建立基于定量质谱和蛋白组学的CETSA方法，实现在全蛋白组水平、高通量和深度化的对靶标和药物的相互作用进行判定[7]，该方法不仅可以区分直接靶标，间接靶标以及非靶标蛋白，还可以深度挖掘一些未知靶标。对于一些有翻译后修饰、水解或者变构，抗体不能识别的靶标的鉴定，基于质谱的CETSA方法具有独特优势[12]。该方法还能够和表型检测相结合，详细解读药物的代谢过程和副作用[13-14]，为临床用药提供指导，为药物设计提供思路。除了在生物医药领域用于药靶鉴定外，基于定量质谱的CETSA方法在合成生物学领域也具有广阔应用前景，如鉴定和优化酶的底物[15]、鉴定新合成蛋白质[16]、验证基因编辑的结果[17]等。因此，我们下一步目标就是建立基于定量质谱的CETSA方法并实现标准化。