抗体

由于对低丰度蛋白进行精确和有效检测的需求得不到满足，人们研发了抗体-寡核苷酸 (Ab-oligo) 偶联物，现已被用于从诊断到治疗的众多应用中。Ab-oligo 偶联物在强化多项生物技术方面发挥着重要作用，这些技术包括免疫学和蛋白质组学研究、生物标志物的发现、临床诊断（包括即时护理）及其他新型技术。因为寡核苷酸具有多个官能团，所以抗体可以通过氨基酸残基轻松地与寡核苷酸偶联，因此适用于大多数体外应用。

胺类偶联

抗体含有多个氨基 (NH2)，它们可以作为赖氨酸 (K/Lys) 侧链ε-胺和 N 端 α-氨基分布于各处（见图 1）。因其空间可及性，这些残基很容易被修饰，是最常被作为偶联靶点的两种残基。除氨基外，谷氨酸和天冬氨酸残基以及羧基(-COOH)也可以通过各自的 C 端进行偶联。然而，抗体表面分布着大量的氨基和羧基官能团，这意味着所使用的的偶联方法可能会导致形成部分有活性/无活性的 Ab-oligo 偶联物，这些偶联物由于位于抗原结合位点的偶联残基的空间位阻而不会与抗原结合，即亲和力降低。

图 1.抗体的结构示意图，显示了常被用作寡核苷酸偶联靶点的官能团（-NH2、-COOH 和 S-S）。

巯基偶联

抗体-寡核苷酸偶联反应也可以通过硫醇基（巯基）进行。抗体包含氧化的巯基 (-SH) 基团，后者以二硫键 (S-S) 的形式存在，有助于形成抗体的三级结构。这些二硫键必须用还原剂（例如 2-ME/SDS）还原，才能暴露其反应基团。

抗体可以被选择性地剪切成两个半抗体分子或更小的抗体片段，例如 F(ab’)2。利用“铰链”区处于游离状态/被还原的 -SH 基团进行偶联，还可以促使附着的寡核苷酸远离抗原结合区，从而防止空间位阻并保持活性。

糖类偶联

还有一种偶联方法是定向偶联，这类偶联可以在糖类残基上进行，主要在 Fc 区进行，因为糖类残基离抗原结合位点较远，不易受空间位阻的影响。要想通过这种复杂的方法进行偶联，必须用高碘酸将糖类基团氧化成醛 (-CHO)。这种方法的优点在于，通过定点偶联技术产生的 Ab-oligos 在体内应用方面具有明显的优势。

免疫聚合酶链反应 (immuno-PCR)

与 ELISA 类似，免疫 PCR 也是一项利用抗体检测和定量混合样本中特定抗原（分析物） 的强大技术。但是，在免疫 PCR 中，Ab-oligo 偶联物会与固定分析物结合，然后通过 RT-PCR 使附着的 DNA 扩增（见图 2）。

在免疫 PCR 中使用 Ab–oligo 偶联物，可以提高蛋白检测和定量的灵敏度；由于它融合了抗体的检测特异性和 RT-PCR 的核酸检测灵敏度，因此明显优于一般的 ELISA 法。20 多年来，将免疫检测与 RT-PCR 进行结合已成为一项标准技术。

由于免疫 PCR 具有强大的扩增能力，而且特异性和灵敏度更高，高出 ELISA 100-10,000 倍，因此检测的下限更低，扩增产物可以通过凝胶电泳进行观察，从而确定结合分析物是否存在。

图 2.免疫 PCR 方法示意图。

邻位连接技术

邻位连接技术（PLA）是由 Fredriksson 等人发明，用于贴壁细胞系、细胞离心涂片或组织样本（包括冷冻或石蜡包埋样本）中单个蛋白或蛋白间相互作用的定位检测、可视化和定量。

该项技术利用的Ab-oligo 偶联物结合在同一蛋白邻近（相距 30-40nm）的不同表位或两种蛋白在一个复合物中。细胞/组织必须用适合所用抗体的固定剂进行固定。如有需要，必须进行抗原修复和抗体特异性封闭。

图 3.直接和间接 PLA 技术。直接法使用的是一抗偶联抗体对，间接法使用的是二抗偶联物。

PLA 有两种不同的方法：直接法和间接法（见图 3）。直接法使用的是 Ab-oligo 偶联物，间接法使用的是未修饰的一抗，这些一抗需用二抗 Ab-oligo 偶联物进行检测。两种方法都会引入两种额外的“连接物”寡核苷酸，并将它们与 Ab-oligo 连接，形成环状单链 DNA 分子。

其中一种 Ab-oligo 偶联物充当单链 DNA 环状模板的滚环扩增 (RCA) 引物。加入 DNA 聚合酶时，会形成一个长链产物，这种产物会共价连接到其中一个 PLA 探针上。RCA 完成时，会出现多次重复的同一序列，因此，可用多个检测寡核苷酸进行杂交，从而进行微定量。

电化学邻位检测

电化学邻位检测 (ECPA) 是一种简单的分离/免洗电化学检测，融合了邻位检测概念和电化学检测。ECPA 产生的直接读数适用于多种蛋白靶点的高灵敏度（低飞摩尔级 (fm) 范围）和选择性定量。

图 4.ECPA 原理示意图。

EPCA 利用与蛋白靶点结合的两个 Ab-oligo 偶联物探针的邻近效应来移动电化学活性标记物 - 亚甲蓝 (MB)，使其靠近带有预组装的硫醇化 DNA/竞争剂单分子层的金电极（图 4）。如果存在蛋白靶点，则使用方波伏安法 (SWV) 定量 ECPA 中的氧化还原电流，而电流的大小直接与靶点浓度有关。ECPA 用于可以获得的抗体对的所有蛋白。

多重检测开发

多重蛋白检测有助于定量使用通用捕获技术同时测定多个样本中的多种目标分析物，从而减少工作流程和样本量问题。但是，这种检测方法受到检测特异性、灵敏度和通量等因素的限制（见图 5）。

图 5.在传统的免疫检测中，抗体的非特异性结合会导致交叉反应，从而限制潜在的多重检测程度。

开展多重免疫检测的方法有很多，大致可分为两类：在固体表面固定，每种分析物在独立的空间内进行检测；固定于磁珠或颗粒上，每种分析物在不同的磁珠/颗粒上进行检测。如今，多重蛋白检测技术利用 DNA 两条互补链之间的特异性结合，将每种同源物对应的一条链（分析物）固定在固体支持物上，例如微量滴定板。将 Ab-oligo 偶联物合并，并与孔内的特定固定捕获寡核苷酸杂交，从而创建抗体阵列（见图 6）。

图 6.由于仅检测并报告了匹配的寡核苷酸对（例如 3A+3B），因此未检测到交叉反应性结合。

以前，连接寡核苷酸和抗体的标准化学过程和方法，执行起来十分困难、耗时，并且需要具备化学修饰技术方面的专业科学知识。如今已开发出简单、高效的高产率技术，可以快速轻松地制备 Ab-Oligo 偶联物。

寡核苷酸偶联技术

我们的寡核苷酸偶联试剂盒 (ab218260) 可以简单快速地偶联抗体与寡核苷酸，材料回收率高，清洁程序出色。该试剂盒反应快、使用简单，克服了标准偶联法耗时和试验方案冗长的问题（见图 7）。

寡核苷酸偶联试剂盒的特点和优势：

图 7.Ab–oligo 偶联过程。Ab–oligo 偶联方案包括三个主要步骤：激活抗体和寡核苷酸，然后脱盐，接着将两者混合并孵育过夜。对于最终使用而言，如果需要去除未结合的寡核苷酸，可以次日早上进行。操作完成后，就可以随时使用偶联物了。

寡核苷酸偶联试剂盒主要用于免疫 PCR、PLA、ECPA、侧向层析、治疗应用中 siRNA 抗体的递送、预靶向肿瘤治疗。

利用寡核苷酸偶联试剂盒获得免疫 qPCR 数据

上面的曲线图绘制了 qPCR 循环次数与含 qPCR 探针的 SYBR green 在特定抗原浓度下产生的荧光强度的关系（见图 8）。下面的曲线图将这些数据转换成了抗原用量与循环次数之间的关系，便于计算标准曲线（见图 9）。

图 8. 含 qPCR 探针的 SYBR green 在特定抗原浓度下产生的循环次数。

图 9. 购于 HyTest 的未偶联特异性人 的CRP小鼠单抗（克隆 C7）。用寡核苷酸偶联试剂盒 (ab218260) 对未偶联抗体和寡核苷酸进行偶联，将未偶联抗体用作夹心免疫 PCR 检测中的检测抗体，并选用一种 CRP 多克隆抗体作为捕获试剂。该曲线图描绘了抗原用量与循环次数的标准曲线。

结果表明，本次检测使用的捕获抗体和检测抗体分别比等效 ELISA 要少 1,000 倍和 100 倍，而且灵敏度也提高了 1,000 倍。

使用我们的寡核苷酸偶联试剂盒设计寡核苷酸的技巧

抗体纯化系统

很可惜，许多抗体的缓冲液中含有与标记技术不兼容的添加剂，因此，在进行偶联反应前，需要重点考虑纯化。因此，我们为您开发了一系列可与我们的标记技术搭配使用的纯化试剂盒。这些试剂盒使用简单、方便，并且经过精心设计，可以与我们的生物偶联试剂盒搭配使用。

参考文献