生物工程学报

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是一种可引起仔猪高致死率的传染性疾病，尽管已有灭活疫苗和减毒活疫苗上市，但由于病毒变异频繁导致保护效力欠佳，发病率依然居高不下。本研究首次制备了PEDmRNA候选疫苗，并在小鼠和妊娠母猪上评价了其免疫原性，证明了基于病毒受体结合区异源二聚体的mRNA候选疫苗具有良好的免疫原性，可在小鼠上高效诱导体液和细胞免疫应答，单次免疫血清中和抗体滴度达到1:300以上，并在妊娠母猪上诱导了与灭活疫苗相近的中和抗体水平，实现了100%抗体转阳。本研究为PED mRNA疫苗的进一步产业化奠定了基础。

DNA疫苗在动物体内表达抗原基因的水平是决定DNA疫苗免疫效果的关键，而提高DNA疫苗抗原基因表达水平的途径之一是利用可在动物细胞内复制的质粒作为载体。本研究利用pcDNA3.1构建了1个基于猪圆环病毒2 (porcine circovirus 2, PCV2)复制子的复制型DNA疫苗载体pCMVori，再将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因分别克隆入pCMVori和对照质粒pcDNA3.1中，然后分别转染PK-15细胞，48h后观察两组转染细胞EGFP表达情况后分别提取细胞质粒和RNA。利用BclI酶切前、后的质粒为模板通过定量PCR检测质粒的复制效率，并通过反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测PCV2复制子的Rep基因转录产物。通过Image J软件分析两组转染细胞的平均荧光强度，并通过定量RT-PCR定量检测两组转染细胞的EGFP基因转录水平。结果显示，pCMVori在细胞内48 h的复制效率达到136%,RT-PCR结果证实Rep和Rep’均有转录。pCMVori-EGFP转染细胞的平均荧光强度比pcDNA3.1-EGFP的高39.14%，定量RT-PCR检测结果显示，前者的EGFP转录水平也比后者高40%。本研究结果表明，所构建的复制型DNA疫苗载体pCMVori可在真核细胞中独立复制，克隆的目的基因的表达水平也因此获得提升，为构建复制型DNA疫苗奠定了基础。

全球有近1/4的人感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)并长期处于潜伏感染状态。Rv2626c是结核分枝杆菌受DosR调控的重要潜伏感染相关蛋白。本研究对Rv2626c蛋白进行了原核表达和纯化，并以RAW264.7细胞和小鼠为感染模型，对其免疫生物学特性进行了分析。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明，Rv2626c-His融合蛋白主要以可溶形式表达，能与兔抗H37Rv多抗血清发生特异性免疫反应。此外，本研究发现Rv2626c蛋白能结合到巨噬细胞RAW264.7表面并上调细胞NO的生成；显著诱导促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和MCP-1的产生；并能诱导小鼠产生更强的Th1免疫应答。上述研究有利于揭示结核分枝杆菌的致病机制，为新型结核病疫苗的研制奠定了理论基础。

生长抑素(somatostatin, SST)作为一种抑制性多肽激素，在多种生物过程中发挥重要的功能。生长抑素受体2 (somatostatin receptor 2, SSTR2)作为生长抑素表达最广泛的受体在多种组织中表达，但其表达的具体细胞类型尚不清楚。本研究在小鼠不同发育阶段的多种组织中鉴定了SSTR2蛋白表达的细胞类型。通过多色免疫荧光在小鼠胚胎期15.5 d、出生后1 d、7 d、15 d、3个月和6个月的脑、骨、肺、肠道、皮肤、胃、脾和肾等组织中检测了Sstr2基因的表达。结果发现Sstr2在不同发育阶段的多种组织的特定细胞类型中表达，包括脑神经元和星形胶质细胞，骨的间充质基质细胞、造血细胞和B细胞，肺的巨噬细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞和气道纤毛细胞，肠道的上皮细胞和神经元，皮肤的毛囊细胞，胃体的上皮细胞，脾的造血干细胞、造血祖细胞和神经纤维，肾的肾小管上皮细胞等。本研究确定了小鼠多组织不同发育阶段Sstr2表达的细胞类型，为生长抑素与生长抑素受体2的生理功能研究提供了新的线索。

为探讨血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2)对传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)诱导细胞炎性反应的调控作用及其机制，本研究以IBV重组病毒(IBV-3ab-Luc)分别感染Vero和DF-1细胞，并设立对照组、感染组[IBV-3ab-Luc，感染复数(multiplicity of infection, MOI)=1]、ACE2过表达组[IBV-3ab-Luc+pcDNA3.1(+)-ACE2]及ACE2缺失组(IBV-3ab-Luc+siRNA-ACE2)。待感染组出现合胞体等明显细胞病变后，提取各组细胞总蛋白质和RNA，免疫荧光及免疫印迹试验(Western blotting)鉴定ACE2的过表达与缺失；实时荧光定量PCR(real-timequantitativepolymerasechainreaction,RT-qPCR)检测细胞中IBV核衣壳(nucleoprotein, N)、糖蛋白130 (glycoprotein 130, gp130)、白细胞介素6 (interleukin-6, IL-6)等炎性因子的mRNA表达水平；酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法测定细胞上清中IL-6水平；Western blotting检测细胞中ACE2表达和酪氨酸蛋白激酶2 (janus kinase 2, JAK2)、信号转导和转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)磷酸化水平。结果表明，Vero和DF-1两种细胞均成功实现ACE2的过表达与缺失。IBV感染可导致Vero细胞变圆、脱落和聚堆，有明显合胞体出现；ACE2过表达后细胞病变减轻；缺失后细胞病变增强。与对照组相比，感染组IBV-N、IL-6和gp130mRNA表达均显著上调(P