有害微藻抑藻细菌多样性及抑藻机制研究进展

有害藻华(Harmful algal blooms，HABs)分为淡水水华和海洋赤潮，是一种水生生态异常现象：当含有大量营养物质的生活污水、工业废水和农业废水流入海洋或湖泊后，在特定的环境条件下(如洋流、温度和海域的封闭程度等)，赤潮生物(浮游植物、原生动物或细菌)、水华生物(蓝藻、绿藻或硅藻等)便会急剧繁殖形成藻华[1]。我国2 000多年前就有关于藻华的记载，在4 000余种微藻中，能形成藻华的有300余种[2]，其中，血红哈卡藻(Akashiwo sanguinea)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)、原甲藻(Prorocentrum)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae)等都是形成藻华的优势藻种。

当前，人类活动导致水体富营养化加剧，世界范围内HABs频繁发生，成为水生态领域的难题。1946年，美国佛罗里达沿岸发生短小裸甲藻赤潮，大量的鱼虾蟹及海龟、牡蛎等被毒杀，海滩上死鱼长达37 km[3]；1972年，日本播磨湾一带发生霍氏眼藻赤潮，造成1 400万尾鱼死亡，损失达71亿日元[4]。2017年中国海洋灾害公报显示，我国海域有害赤潮发生的频次明显增加，仅2017年就发现赤潮68次，6月福建省暴发链状裸甲藻赤潮最为严重，影响面积达60 km2，多人因食用贝类产品导致中毒，在牡蛎、贻贝中均检测到麻痹性贝毒(Paralytic shellfish poisoning，PSP)。有毒藻类的存在对沿海地区养殖业、人类健康及海洋生态安全存在严重威胁。甲藻是典型有毒藻类，如亚历山大藻、链状裸甲藻能产生麻痹性贝毒(PSP)；原甲藻、鳍藻能产生腹泻性贝毒(Diarrhetic shellfish poisoning，DSP)；短凯伦藻产生神经性贝毒及毒性冈比甲藻产生西加鱼毒(Ciguatera fish poisoning，CFP)。水生生物食用后可能死亡或累积于体内，通过食物链不仅破坏水生生态系统的结构和功能，还可对人类造成不同程度的伤害甚至死亡[5]。

海洋赤潮、淡水水华的防治刻不容缓，已成为当前研究的热点和前沿科学问题。寻找能够有效防治HABs的方法是现阶段水生生态保护与修复领域的重要研究内容。当前，物理方法和化学方法已被广泛用于藻华治理，具有良好的治理效果。然而，外来添加物质不可避免会造成二次环境问题，且对其他生物产生直接或间接副作用，如广泛使用的化学抑藻剂CuSO4不仅能加速藻毒素的释放，且高浓度的铜离子会造成水体重金属污染，导致浮游植物及水生动物的死亡[6]；物理方法中大量使用的粘土悬浮于海水或沉积于海底，淤渣量过大对虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)的生长及存活率有一定的影响[7]。现阶段，环境友好型藻华防治新技术日益受到人们的重视，如利用大型海藻或微生物与微藻间的相互作用来防治藻华。其中，微生物因其分布广、种类多、代谢繁殖快及环境友好等特点，在有害藻华防治方面表现出巨大潜力。

本文在总结当前研究基础上，从抑藻细菌分布、物种多样性和抑藻方式，抑藻菌作用下藻细胞形态、光合作用、氧化应激和细胞凋亡等角度对当前有害微藻微生物防治研究进展进行梳理总结，以期为藻华微生物防治技术研发提供参考。

抑藻微生物广泛分布于地表水环境(海洋、湖泊、池塘、水库、沼泽等)和土壤环境中。尤其是在水华和赤潮暴发的环境中，抑藻微生物的生长和代谢通常变得非常活跃，它们通过分泌抑藻物质、竞争氮磷等营养物质或直接接触等方式对赤潮的生长产生抑制作用，在水华和赤潮自然消减过程中发挥着重要作用。

淡水中蓝藻、硅藻、绿藻等大量繁殖导致水华。目前淡水环境中的抑藻微生物主要分离自微藻生长或水华环境。Shilo从水塘中筛选黏细菌(Myxobacteria)测试其对10种蓝藻的抑制效果，结果发现8种蓝藻被杀死[8]；Daft等从淡水中分离出9种黏细菌，可溶解鱼腥藻、束丝藻、微囊藻以及多种颤藻[9]；Imamura等从日本琵琶湖分离到一株鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)，该菌能分泌抑藻活性物质——五肽，对铜绿微囊藻有着较强的抑藻效能，但对小球藻无任何作用[10]；Furusawa等从日本鹿儿岛湾分离到1株腐螺旋菌(Saprospira)，该细菌能捕获硅藻，使藻细胞聚集在一起，直接接触破坏藻细胞壁，侵入并溶解藻细胞[11]。

海水中浮游微藻的大量繁殖可导致赤潮。目前海洋环境中的抑藻微生物主要分离自赤潮环境。Lee等从日本阿里克海分离到一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.) A28，结果表明，菌株A28产生丝氨酸蛋白酶对骨条藻(Skeletonema)表现出抑藻活性[12]；韩光耀等从赤潮暴发海域分离到一株细菌DH-e，鉴定为盐单胞菌(Halomona)，其代谢产物加速东海原甲藻(P. donghaiense)叶绿素a的分解，胞内总糖含量降低[13]。

土壤由于具有丰富的碳源、氮源及矿物质元素，孕育着大量的微生物，其中不乏对有害藻华具有抑制作用微生物的存在。近期本课题组研究发现，土壤环境中的部分微生物(黄杆菌、假交替单胞菌、玫瑰库克氏菌)进入海洋环境也能生存并发挥抑藻作用[14]。轩换玲从重庆紫金土中分离到一株链霉菌(Streptomyces)，不仅能造成铜绿微囊藻(M. aeruginosa)黄化死亡，还引起蓝藻(颤藻、席藻、水华鱼腥藻)藻丝断裂[15]；土壤细菌缺陷短波单胞菌AA06分泌类腐殖酸物质，使藻细胞失活后聚集在一起，破坏细胞膜，进而逐渐溶解整个藻细胞[16]；Lu等从中国东海底泥沉积物中筛选到海旋菌(Thalassospira)，该菌株通过产生苯甲酸促进米氏凯伦藻(K. mikimotoi)细胞破裂和胞内内容物外泄[17]。

极少抑藻细菌分离自藻细胞内部。Zheng等从东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)藻细胞内分离到红杆菌(Rhodobacteraceae) PD-2，该菌株能产生抑制寄主生长的活性物质，且可以合成N-酰基丝氨酸内酯信号[18]。

自1925年，Geitler首次发现一种寄生在刚毛藻上的黏细菌具有溶藻作用[19]，越来越多抑藻细菌被分离到。本文中整理到的抑藻细菌多达42种(表 1)，广泛分布于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinomycetes)、厚壁菌门(Firmicutes)以及栖热菌门(Thermus) (图 1)。

大多数抑藻菌隶属于变形菌门，约占已报到抑藻菌总数的65%。其中又以γ-变形菌纲居多，包括假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)等17种不同菌株；α-变形菌纲主要包括鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)等8种抑藻微生物；β-变形菌纲主要包含海旋菌(Thalassospira)、陶厄氏菌(Thauera) 2种抑藻微生物。其中，假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)、盐单胞菌属(Halomonas sp.)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)等菌株既分布于陆地环境，又存在于水生环境中。

拟杆菌门分离到的抑藻微生物约占抑藻菌总数的19%，主要分布在拟杆菌纲、黄杆菌纲、鞘脂杆菌纲。这些微生物包括黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、纤维菌属(Cellulomonas)、噬纤维菌属(Cellulophaga sp.)、苏特氏菌属(Joostella sp.)、海水菌属(Aquimarina)、金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)、栖海杆菌属(Maribacter sp.)及腐螺旋菌属(Saprospira sp.)。其中，黄杆菌是常见抑藻菌，该菌属既存在于海洋环境中，又存在于土壤和淡水环境中，能够间接抑制水华有害藻铜绿微囊藻(M. aeruginosa)的生长，直接攻击赤潮有害藻海洋原甲藻(Prococentrum marinum)[53]。

放线菌门分离到的抑藻微生物约占抑藻菌总数的7%。链霉菌属(Streptomyces sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)及节杆菌属(Arthrobacter sp.)是该门中常见的抑藻菌株。其中，链霉菌是放线菌门中最常见的抑藻菌，该菌大多分离自土壤，能够有效防控铜绿微囊藻(M. aeruginosa)造成的水华，对赤潮有害藻类，如赤潮异弯藻(H. akashiwo)，也发挥抑制作用[54]。

厚壁菌门分离到的抑藻菌约占抑藻菌总数的7%。目前该门已报道的抑藻菌株有芽孢杆菌(Bacillus sp.)、动性微球菌(Planomicrobium sp.)及微小杆菌(Exiguobacterium sp.)。其中，芽孢杆菌具有极强生命力，广泛存在于水、土壤、空气等环境中。有些芽孢杆菌可以直接进入藻细胞或者遮挡光源来抑制藻细胞的生长，但大多数芽孢杆菌是通过释放抑藻物质来间接抑藻，如，许波研究发现解淀粉芽孢杆菌T1代谢产物中赖氨酸和苯丙氨酸协同作用抑制水华微藻[55]。

目前，栖热菌门只报道了一株抑藻菌奇异球菌(Deinococcus sp.)，该菌对赤潮藻亚历山大藻(A. tamarense)具有显著抑制作用[52]。

直接抑藻是以藻菌直接接触的形式抑制有害藻类。有些细菌直接与藻细胞接触，释放破坏藻细胞壁的酶类物质消化细胞壁，进而逐渐溶解藻细胞，如Li等研究发现几丁酶产生菌LY03对微藻表现出了趋化性，依靠鞭毛作用靠近藻细胞，分泌几丁质酶溶解藻细胞壁，最后导致藻细胞溶解并死亡[56]；腐螺旋菌(Saprospira)也是直接破坏硅藻细胞壁，使其溶解死亡[11]；Caiola等从铜绿微囊藻细胞中得到一株类似蛭弧菌的细菌，该菌侵入藻细胞并停留在细胞壁和细胞质膜之间，通过分解藻细胞结构来溶解细胞[57]。有些细菌既可以直接接触抑藻，又可以分泌抑藻物质间接抑藻，Sun等报道了假交替单胞菌的滤液和菌体对红哈卡藻均具有抑制效果[29]。

多数抑藻菌通过与微藻竞争营养或者向环境中释放抑藻活性物质以藻菌非接触的形式间接抑制或杀死微藻，这些抑藻活性物质包括酶、蛋白质、多肽、氨基酸、抗生素、色素、吲哚醌、脂类等[58-59]。细菌生长代谢可迅速消耗大量氮源从而降低环境中可供微藻生长的氮源。Jansson研究发现细菌对磷酸盐的利用效率远远高于藻类[60]。瞿建宏等研究发现氮磷比值能调节藻菌的生长动态，当氮磷比值升高时，抑藻菌能够竞争更多的营养物质，进而导致微藻生长受到抑制或死亡[61]。王以斌等从黄杆菌发酵液中提取到抑藻物质灵菌红素，促使亚历山大藻丙二醛含量增加，巯基含量降低，细胞膜结构受损进而抑制微藻生长[62]。弧菌BS02分泌的棕榈油酸(C16H30O2)能够高效地杀灭塔玛亚历山大藻[63]。芽孢杆菌Y4分泌六氢吡咯并[1, 2-a]吡嗪-1, 4-二酮和酰胺类物质，能够显著抑制球形棕囊藻的生长[64]。在微藻共栖菌中，变形菌门中的红杆菌、亚硫酸杆菌、海杆菌、寡养单胞菌能够向环境中释放含有苯环的物质，该物质可以不同程度的抑制东海原甲藻、棕囊藻、海链藻和赤潮异湾藻的生长[65]。

抑藻细菌对微藻细胞结构的影响，主要体现在细胞膜的完整性，细胞核的形态、位置和完整性，叶绿体的形态和完整性，以及染色体DNA的变化。细胞膜损伤是抑藻细菌杀死藻细胞的重要途径。细胞膜的完整性是藻细胞正常生存的基础，其能够吸收营养物质，排出代谢废物，同时具有识别、免疫的功能。有报道表明芽孢杆菌无菌滤液能在短时间内破坏球形棕囊藻细胞膜的完整性，导致细胞内容物溢出，进而溶解整个藻细胞[66]。Pokrzywinski等报道了抑藻活性物质IRI-160AA对微型原甲藻、剧毒卡尔藻、条纹环沟藻显微结构和亚显微结构的影响：药物作用下，微型原甲藻细胞膜完整无损，叶绿体呈现颗粒状且增大，细胞核破裂，染色体溶解，DNA释放在细胞的边缘部分；剧毒卡尔藻叶绿体数目增多，细胞核完整，但叶绿体和细胞核被转移到细胞边缘，成为一个凸起；条纹环沟藻由于细胞核扩张导致细胞体积增大，细胞膜完整，叶绿体出现颗粒状且皱缩，染色体松散变形，DNA释放[67]。这些现象又表明抑藻细菌对不同微藻细胞结构的影响存在多样性。

叶绿体是微藻进行光合作用的基础，叶绿体受到损伤将直接导致藻细胞光合系统受到抑制，进而影响藻类的正常生长。目前对抑藻过程中微藻光合系统响应的研究主要集中在叶绿素a含量、类胡萝卜素含量、最大光量子产量、光合基因psbA、psbD和rbcL转录量的变化[64]。叶绿素a在藻类光合作用中起着吸收传递光能的作用，河氏菌属KA22抑藻物质作用下，球形棕囊藻藻细胞叶绿素a含量降低，光能传递受阻[40]；胡萝卜素是光合作用的辅助色素，防止光敏化伤害造成的氧化损伤，类胡萝卜素含量降低，藻细胞对氧化损伤的抵御能力变弱[64]；最大光量子产量是指PSⅡ反应中心最大的光能转换效率，海洋抑藻弧菌DHQ25作用下，亚历山大藻细胞Fv/Fm值下降，说明PSⅡ的光合能量传递受阻，藻细胞无法进行正常的光合作用；且在PSⅡ的电子传递链中，可能会产生过多是活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，破坏藻细胞膜系统和色素的合成[68]；psbA和psbD分别是藻细胞光合系统Ⅱ光合反应中心蛋白D1和D2的编码基因，芽孢杆菌LP-10作用下，球形棕囊藻细胞psbA和psbD的转录量降低，说明D1和D2蛋白的合成受阻[69]；rbcL是与二氧化碳的固定有关的基因，芽孢杆菌抑藻物质-二酮哌嗪作用下，球形棕囊藻rbcL基因的相对转录量降低[70]。

藻类氧化应激是指当藻细胞受到外界或自身代谢产生的各种有害刺激时，胞内活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)或活性氮自由基(Reactive nitrogen species，RNS)含量增多，导致氧化与非氧化失衡，从而造成藻细胞受到损伤。藻类本身具有一套完整的抗氧化系统，包括酶抗氧化系统[超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)]和非酶抗氧化系统(维生素E、维生素C、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽、类胡萝卜素等)。吴培枫等研究发现随着溶藻菌DH-Ed的无菌滤液体积比的增加，东海原甲藻ROS含量会随之增高，且藻细胞内SOD和CAT活性增强，说明藻细胞启动了抗氧化防御系统来消除过量的氧自由基[71]。但是，越来越多的研究表明，抑藻物质达到一定浓度，藻细胞内ROS过度积累，进而导致藻细胞抗氧化防御系统崩溃，膜脂过氧化程度加剧[70]。目前，关于抑藻细菌胁迫下微藻非酶抗氧化系统的报道相对较少，但是氧化应激启动后，细胞酶类和非酶类抗氧化剂通常同时启动，以避免机体受到氧化损伤[64]。

已有研究表明，在营养盐限制、高盐、黑暗、辐射、化学试剂等胁迫下，微藻可能发生细胞的程序性死亡，如假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)在铁限制条件下，细胞内ROS活性增加，细胞表现出凋亡现象[72]。近期研究表明ROS可能是导致藻胞凋亡的关键因素之一，藻细胞受到不利因素胁迫时，胞内ROS过量累积，导致线粒体膜电位降低，细胞色素c释放，致使线粒体功能紊乱，进而引发类似Caspase蛋白酶活性升高，藻细胞发生凋亡。张立阳报道了在抑藻物质不饱和脂肪酸作用下，米氏凯伦藻和东海原甲藻ROS含量增多，线粒体膜电位降低，细胞色素c释放，类似Caspase-3, 9蛋白酶含量升高，流式细胞术检测藻细胞发生凋亡[73]；希瓦氏菌TS-6溶藻活性物质作用于球形棕囊藻后，ROS含量增加，且磷脂酰丝氨酸外翻，类似Caspase-3活性增强，DNA出现片段化，表明有细胞凋亡现象发生[74]；产微球茎菌属BS03 (Microbulbifer sp.)胁迫下，塔玛亚历山大藻细胞内ROS含量增加，类似Caspase-3活性显著高于对照组，也呈现出细胞凋亡现象[75]。

藻细胞通过细胞分裂不断进行着生命的传递，不同的外界胁迫会伴随着细胞周期的变化。研究表明许多非生物和生物的胁迫因素都阻滞了藻类细胞周期的正常循环，例如磷酸二氢酶抑制剂——IBMX可以将鞭毛藻细胞周期在G1/S和G2/M期被阻滞[76]；纤维素酶抑制剂将鞭毛藻细胞周期阻滞在G1和G2/M期[77]。抑藻菌胁迫下，对藻细胞周期也会产生影响，Pokrzywinski等研究了抑藻细菌希瓦氏菌(Shewanella sp.)活性物质IRI-160AA对3种有害鞭毛藻微型原甲藻、剧毒卡尔藻、条纹环沟藻细胞周期的影响，结果表明抑藻物质可以抑制3种微藻S期到G2/M期的进展[26]；因此，不同胁迫因子作用于不同细胞，会对细胞周期产生不同差异。目前关于抑藻细菌对细胞周期调控的研究鲜有报道，深入探究抑藻细菌对藻细胞周期的阻滞效应，为更好地探索抑藻菌抑藻机制提供新的靶点。

抑藻细菌广泛分布于地表水和土壤环境中，具有较高物种多样性，这些抑藻菌主要分布于变形菌门(α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲)、拟杆菌门、放线菌门和厚壁菌门。尽管抑藻细菌广泛分布于自然环境中，然而，现阶段抑藻菌在抑藻方面的应用仍停留在室内模拟阶段，尚未被有效应用于有害藻暴发水域。尽管水生态系统中富含大量营养物质，能够满足细菌生长繁殖，但与实验室提供的营养条件下相比，其在自然环境中生长要缓慢许多，且不足以产生足够的抑藻物质。基于微生物的环境修复技术主要分为原位营养刺激和外源优势微生物强化两种类型。原位营养刺激通过向目标区域投加特定的营养物质选择性促进目标微生物的快速生长代谢，从而实现环境修复目的。外源微生物强化通过向目标区域投加性能良好的功能微生物及营养物质或其代谢产物实现环境修复目的。这两种方法都需要向环境中投加额外的营养物质以便促进目标微生物快速生长，大量合成用于环境修复的代谢产物。因此，营养物质的引入势必会对环境造成二次污染压力。外源菌引入后与目标区域生态系统的配伍性也是制约抑藻微生物应用的重要因素，如抑藻菌抑制有害赤潮藻的同时，对其他微型浮游生物和鱼虾等产生生态毒理效应[78]。此外，环境的复杂性，如海洋环境下洋流、温度、阳光和其他微型生物的捕食和降解作用，也会影响抑藻微生物防治有害藻华的效果[79]。

抑藻菌主要通过分泌抑藻物质间接抑藻。抑藻细菌种类繁多，注定抑藻物质极具多样性，如何快速高效分离抑藻物质及抑藻物质的结构解析仍是当下研究亟待解决的关键科学问题。抑藻菌抑藻过程中，藻细胞会产生不同程度的氧化应激，当胞内产生的过量活性氧自由基得不到及时清理时，活性氧自由基就会引发含有膜结构的细胞器发生脂质过氧化，并通过引发一定的级联反应促使藻细胞发生凋亡。现阶段，对抑藻作用下藻细胞氧化应激和藻细胞结构和功能方面的研究已经相对比较深入。但是，目前大部分微藻基因组信息缺乏或处于不公开以及缺少成熟高效的基因编辑技术，抑藻机理的研究仍十分浅显，如在抑藻物质作用下，可以通过流式细胞术获知藻细胞周期被阻滞在某个周期，但是由于缺乏足够的基因组信息，深层的分子机制(如关键基因的鉴定、转录和表达)研究十分困难。因此，有害藻遗传信息的解析以及抑藻物质作用下关键功能基因的响应应该成为接下来的重要研究课题。