基因组Survey测序分析

        使用医蛭样品的基因组DNA构建270 bp文库，在 Illumina Hiseq测序平台测序并过滤得到12.43 Gb高质量的数据，总测序深度约为76 ×，测序数据Q20比例均在95.34%以上，Q30比例均在89.23%以上，满足合同要求的50 ×以上的测序数据量。文库高质量的数据量的统计信息见表2。

表2   样品测序结果统计表

注：Library：调研图的测序文库；Data (Gb)：相应测序文库的测序数据量；Depth (×)：测序深度；Q20 (%)：测序质量值在20以上的碱基比例；Q30 (%)：测序质量值在30以上的碱基比例。

        样品如果存在污染不仅会降低有效数据量，同时还会影响调研图分析结果的准确性，导致基因组大小、杂合率、重复序列比例和GC含量等基因组特征评估结果出现较大偏差，使得基因组组装建库策略出现偏差，最终影响后续的基因组组装效果。为了判断提取的样品DNA是否受到污染，我们从测序得到的270 bp文库中，随机取10,000条单端reads，与NT库进行BLAST[1]比对，270 bp文库能够比对上NT库的reads分别占总reads数的1.71%，其中比对到xx 和xx上的reads数分别占比对上NT库reads数的34.5%和6.43%，这两个物种皆为医蛭的近缘物种，且比对结果中未发现植物等异常比对，因此该样品测序数据不存在污染，可用于基因组调研图分析。一般的评估标准：如果有一定比例的reads比对上进化距离较远的物种如植物，微生物等，则判断样品可能存在污染，需要进一步检查原因。具体比对统计表见表3。

表3   270 bp文库NT库比对详表

注：Species：比对上的物种名称；Aligned percentage (%)：比对到该物种的reads占所有比上NT库reads的比例。

        由于线粒体中存在核酸序列，如果物种测序文库中线粒体DNA含量过高时，会影响后期基因组组装。因此评估文库中线粒体DNA含量对判断数据能否用于后续基因组组装非常必要。为了评估测序数据中线粒体的含量，我们利用Illumina Hiseq测序得到的270 bp文库与医蛭近缘物种的线粒体序列（42,362 bp）进行SOAP[2]比对。比对结果发现双端比上的reads数为166，占总reads的0.00%，单端比上的reads数为13，占总reads的0.00%，这两个的比例都低于经验值5%。由此判断270 bp文库测序数据的质体含量很低，不影响后期基因组的组装。比对统计结果见表4。

表4-1   270 bp文库SOAP比对结果统计表

注：Type：比对上的reads的类型；Aligned reads number：比对上的reads条数；Total reads number：总的reads条数；Percentage (%)：比对上的reads占总的比例。

        利用基因组调研图进行基因组特征的评估，分为四个方面：

1) 评估基因组大小;

2) 评估重复序列比例；

3) 评估杂合情况；

4) GC含量情况。

        利用270 bp文库数据构建k=19的kmer分布图（见图3），进行基因组大小、重复序列比率和杂合率的评估。由图3知，平均kmer深度即主峰对应的kmer深度为62。kmer深度出现在主峰对应深度2倍以上的序列为重复序列，即深度大于125的kmer序列为重复序列。kmer深度出现在主峰对应深度一半处的序列为杂合序列，即深度出现在31附近的kmer序列为杂合序列。根据kmer深度信息，总kmer数目/平均kmer深度即为基因组大小，估计基因组大小约162.99 Mbp。依据kmer分布情况，估计重复序列含量约16.23%，评估出的杂合率约为1.79%，因此该物种基因组属于高杂合的复杂基因组。

图3 Kmer分布图

        基因组GC含量对二代基因组测序的随机性有较大影响。过高(>65%)或过低(