用于第三代单分子测序的PCR产物测序文库构建方法与流程

本发明涉及文库构建技术领域，尤其涉及一种用于第三代单分子测序的pcr产物测序文库构建方法。

背景技术：

pacbio(pacificbiosciences)测序仪是基于单分子测序的第三代测序仪，目前主要包括rsii和sequel两个型号，由于其具有超长读长的特点，逐渐在基因测序市场中占据越来越高的地位。然而，该平台目前还存在一些缺点。现在的pacbio官方建库试剂主要针对的是全基因组测序，特别是超长片段不经过pcr扩增的原始dna片段建库，包括5k、10k、20k以及更长的插入片段。但该套试剂应用于pcr产物建库时则存在部分试剂以及流程多余的情况，且成本过高，限制了该平台的使用。

技术实现要素：

本发明提供一种用于第三代单分子测序的pcr产物测序文库构建方法，相对于现有的第三代单分子测序的文库构建方法，本发明更加适用于pcr产物建库测序。

本发明通过以下技术方案实现：

一种用于第三代单分子测序的pcr产物测序文库构建方法，包括：将pcr产物进行末端修复和加a反应之后，与接头序列连接，其中上述接头序列是单一序列，从5’端的第一个碱基开始有一段序列与从3’端的第二个碱基开始的一段对应序列互相配对，且3’端的第一个碱基是t碱基，并且上述接头序列中间部分有一段序列不能互相配对，使得上述接头序列自配对后形成具有突出的3’端t碱基、配对双链序列和不配对的环状结构的形式；上述接头序列连接之后，进行外切酶消化和纯化，得到上述pcr产物测序文库。

进一步地，上述第三代单分子测序是pacbio测序。

进一步地，上述接头序列具有seqidno：1所示的序列。

进一步地，上述pcr产物选自16srdna或转录组dna。

进一步地，上述pcr产物的长度大于5kbp。

进一步地，上述pcr产物的长度是5-20kbp。

进一步地，上述外切酶是exoiii和exovii外切酶。

进一步地，上述纯化采用磁珠纯化。

进一步地，上述方法还包括检测文库片段大小的步骤。

进一步地，上述文库片段为单一峰，无杂峰；且上述文库片段大小相对于上述pcr产物的片段大小提高150-250bp。

本发明的测序文库构建方法以pcr产物作为建库对象，相比原始的基因组片段而言，pcr产物比较完美，没有缺口等缺陷，因此不需要进行碱基修复，降低了建库的试剂成本(每个反应试剂成本由接近2000元降低至约100元)，减少建库周期。更重要的是，采用带t的接头以及采用a-t连接方法，其连接效率相比pacbio官方建库试剂和方法大大提高。因此，本发明的方法解决了建库成本过高的问题，并且针对pcr产物建库，简化了现有的建库流程和试剂，使其更加适用于pcr产物建库测序。本发明的方法广泛地适用于全长16srdna建库和全长转录组建库等。

附图说明

图1为本发明一个实施方式中的接头序列自配对后的结构状态图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明针对现有的第三代单分子测序(尤其是pacbio测序)的文库构建应用于pcr产物的文库构建中，存在试剂成本过高，建库步骤复杂，以及连接效率较低等技术问题，从接头序列的设计入手，构思出本发明的用于第三代单分子测序的pcr产物测序文库构建方法。

本发明方法的典型特点是，接头序列具有独特的结构设计。该接头序列是单一序列，即不同于通常的双链互补序列，本发明的接头序列是单链序列，只有一条序列链，从5’端的第一个碱基开始有一段序列与从3’端的第二个碱基开始的一段对应序列互相配对，且3’端的第一个碱基是t碱基，并且接头序列中间部分有一段序列不能互相配对。如图1所示，本发明一个实施方式中的接头序列自配对后的所形成的结构状态包括：突出的3’端t碱基101、配对双链序列102和不配对的环状结构103。

本发明的接头序列自配对后的所形成的结构具有一个突出的3’端t碱基，而pcr产物进行末端修复和加a反应之后形成具有3’端a碱基的产物，二者可以通过a-t碱基配对进行粘性末端连接，相比现有技术中的平末端连接，本发明的连接效率大大提高，降低了试剂使用量，也能进一步降低建库成本，并且本发明的方法不需要进行碱基修复等步骤，因此简化了现有的建库流程和试剂。

本发明的方法典型地可以应用于pacbio测序的测序文库构建，在这种情况下，为了保持与pacbio测序仪后续测序操作的兼容性，采用序列atctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatt(seqidno：1)所示的序列作为接头序列。

本发明的方法可以用于超长pcr产物的文库构建，pcr产物的长度可以大于5kbp，优选5-20kbp。相比现有其他类型的pcr产物的文库构建(例如非用于第三代单分子测序的文库构建)方法而言，本发明的方法能够实现超长pcr产物的文库构建，进而实现超长pcr产物的全长测序。

由于接头序列连接之后，在反应体系中会存在未反应的pcr产物和多余的接头序列，它们会影响后续测序反应的进行，因此需要使用外切酶消化这些未反应的pcr产物和多余的接头序列，典型地，可以使用exoiii和exovii外切酶。

本发明的方法中，产物纯化可以使用各种dna纯化方法，比较典型的是采用磁珠纯化。

为了检测测序文库构建的效果，本发明的方法还需要检测文库片段大小，一般而言，在pcr产物单一的情况下，文库片段表现为单一峰，无杂峰，则说明文库质量较好；并且文库片段大小相对于pcr产物的片段大小提高150-250bp，则表明建库成功。具体可以使用安捷伦2100生物分析仪(agilent2100bioanalyzer)对样品及最后所得文库进行qc质检。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解的是，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例

1、接头制备：

接头(adapter)序列为：atctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatt(seqidno：1)，进行稀释和退火。

2、pcr产物制备

取1μgpcr产物进行后续文库构建，并另取1μl样品留样，用于后续qc质检。

3、末端修复及纯化

3.1末端修复：

根据表1配制末端修复混合物(mix)，每管样品中加入25μlmix，充分混匀，短暂离心后，放入恒温混匀仪(thermomixer)20℃温浴30min。

表1：1个末端修复反应体系

3.2磁珠纯化

1)将磁珠从4℃冰箱中取出，室温平衡30min。

2)使用前振荡混匀，向样品管中加入1.8倍体积(180μl)磁珠，轻轻混匀后室温下静置10min。

3)瞬时离心3s后，将离心管放到磁力架上至液体澄清，需2-5min。

4)用移液器小心的去除上清。注意不要吸到磁珠。

5)保持离心管在磁力架上，加入500μl70％的乙醇，注意不要吹打到磁珠。加完盖上离心管盖，将磁力架上下颠倒混匀3次，去上清。

6)重复步骤5)，此步在去上清时注意移去残留在管盖上的乙醇。

7)将离心管开盖置于干浴仪，37℃干燥5-10min直到磁珠干裂，注意避免过度干燥。

8)加入30μl分装水，用枪吹打混匀使磁珠充分溶解，室温静置5min。

9)将离心管放到磁力架上至液体澄清，大约需要2-3min。

10)将28.1μl洗脱下来的dna转入到新的标注了的1.5ml离心管中。

4、末端加“a”

1)预先从-20℃保存的试剂盒中，取出bluebuffer和datp，于室温解冻，并充分震荡混匀并离心备用。

2)根据表2配制加“a”mix，每管样品中加入6.9μlmix，充分混匀，短暂离心后，放入恒温混匀仪(thermomixer)37℃温浴30min。

表2：1个加“a”反应体系

5、末端连接接头序列(adapter)

5.1加接头序列：

1)预先从-20℃保存的试剂盒中，取出连接缓冲液(ligationbuffer)、接头序列和datp，于室温解冻，并充分震荡混匀并离心备用。

2)根据表3配制加连接序列mix，每管样品中加入15μlmix，充分混匀，短暂离心后，放入恒温混匀仪(thermomixer)16℃温浴12-16h(过夜)，后65℃温浴10min，冷却至4℃。

表3：1个加接头反应体系

6、净化模板

6.1加外切酶消化

根据表4，向加完接头的dna溶液中加入外切酶exoiii和exovii，恒温混匀仪(thermomixer)中37℃温浴1h，冷却至4℃。

表4：1个酶切反应体系

6.2磁珠纯化

1)将磁珠从4℃冰箱中取出，室温平衡30min。

2)使用前振荡混匀，向样品管中加入1.8倍体积(180μl)磁珠，混匀后室温下静置10min。

3)瞬时离心3s后，将离心管放到磁力架上至液体澄清，需2-5min。

4)用移液器小心的去除上清。注意不要吸到磁珠。

5)保持离心管在磁力架上，加入500μl70％的乙醇，注意不要吹打到磁珠。加完盖上离心管盖，将磁力架上下颠倒混匀3次，去上清。

6)重复步骤5)，此步在去上清时注意移去残留在管盖上的乙醇。

7)将离心管开盖置于干浴仪，37℃干燥5-10min直到磁珠干裂，注意避免过度干燥。

8)加入15μl分装水，用枪吹打混匀使磁珠充分溶解，室温静置5min。

9)将离心管放到磁力架上至液体澄清，大约需要2-3min。

10)将15μl洗脱下来的dna转入到新的标注了的1.5ml离心管中。

7、qc质检

使用agilent2100bioanalyzer对样品及最后所得文库进行qc质检，检测文库片段大小及文库浓度，若文库片段为单一峰，无杂峰，表明文库质量较好；同时比较文库片段是否较样品片段大小提升150-250bp，若文库片段大小提升，表明建库成功。

按照以上步骤，分别使用本发明的方法和pacbio官方试剂构建两个pcr产物的pacbio文库，共四个文库，最终成功率100％。使用pacbiorsii测序仪进行测序，分别上1个smrtcell，获得四个cell数据产量和质量见下表5。

表5

本发明的测序文库构建方法以pcr产物作为建库对象，相比原始的基因组片段而言，pcr产物比较完美，没有缺口等缺陷，因此不需要进行碱基修复，降低了建库的试剂成本(每个反应试剂成本由接近2000元降低至约100元)，减少建库周期。更重要的是，采用带t的接头以及采用a-t连接方法，其连接效率相比pacbio官方建库试剂和方法大大提高。因此，本发明的方法解决了建库成本过高的问题，并且针对pcr产物建库，简化了现有的建库流程和试剂，使其更加适用于pcr产物建库测序。本发明的方法广泛地适用于全长16srdna建库和全长转录组建库等。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。