骨内液体流动生物力学的研究进展

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北京理工大学 宇航学院（北京 100081）, School of Aerospace Engineering, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, P.R.China

北京理工大学 宇航学院（北京 100081）, School of Aerospace Engineering, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, P.R.China

骨重建是以骨形成和骨吸收为特征的重要生理过程，人们早已发现骨组织受到力学载荷作用后，会通过骨重建过程优化其结构以适应变化的载荷环境。目前已有大量研究证实，载荷作用下骨内孔隙结构中的液体会发生流动，所产生的流体剪切力是使骨组织细胞产生生物学响应的主要因素。本文综述了近年来骨内液体流动方面的相关研究进展和成果，主要包括流体刺激下骨组织细胞的生物学响应，骨孔隙中的压力及其对液体流动的影响，以及骨内液体流动的实验、理论及数值模拟研究，并对骨内液体流动研究未来的发展趋势加以分析和展望。

It has been found for more than one century that when experiencing mechanical loading, the structure of bone will adapt to the changing mechanical environment, which is called bone remodeling. Bone remodeling is charaterized as two processes of bone formation and bone resorption. A large number of studies have confirmed that the shear stress is resulted from interstitial fluid flow within bone cavities under mechanical loading and it is the key factor of stimulating the biological responses of bone cells. This review summarizes the major research progress during the past years, including the biological response of bone cells under fluid flow, the pressure within bone cavities, the theoretical modeling, numerical simulation and experiments about fluid flow within bone, and finally analyzes and predicts the possible tendency in this field in the future.

生命体的骨骼系统发育完成后，仍会持续进行旧骨吸收及新骨生成以维持正常的骨矿含量，这一过程通常称为骨重建。自从 19 世纪 90 年代德国骨科医生 Julius Wolff（1836–1902）提出所谓“Wolff 定律”以来[1]，已有大量研究表明：当骨组织受到力学载荷作用时，会启动骨重建过程，从而使骨骼结构发生优化调整，以适应变化的载荷环境。通常而言，适当的运动和力学刺激会促进骨内矿物含量的增加，反之当力学刺激缺失时会引起骨丢失。例如，执行长期空间飞行任务的宇航员骨丢失情况非常严重，股骨部位骨矿含量每月下降 0.4%～1.8%。但这种空间微重力环境下骨丢失的原因仍不清楚，也尚无有效的预防和治疗措施[2]。

骨骼一般由密质骨、松质骨和骨髓液组成，例如股骨外部由结构紧密、低孔隙率的密质骨包裹，内部则是杆状和板状骨小梁交织形成三维网状结构的松质骨（图 1a、b）。密质骨主要由骨单位组成，骨单位的管状中心区域称为哈弗氏管，管周围的多层骨基质内含有成骨细胞和骨细胞。与哈弗氏管垂直排列的福克曼氏管将骨单位连接在一起，血管经由哈弗氏管-福克曼氏管系统将营养输运到密质骨内侧，并将代谢产物运走。在骨单位中还有尺度更小的孔隙结构，即骨陷窝-骨小管系统。骨细胞位于骨陷窝中，通过骨小管通道内的突触与邻近骨细胞相互连接（图 1c）。骨细胞突触及骨小管壁之间的空隙中充满了间隙液及胞周基质，两者通过纤维突起直接连接在一起。骨陷窝-骨小管系统在骨细胞间、骨细胞与血管间营养和代谢废物交换中发挥着关键作用，研究者们普遍认为骨陷窝-骨小管系统主导了骨内的力刺激传导过程。

Structure of bones　a. femur; b. the microstructure of compact and cancellous bone; c. lacunar-canalicular stucture

骨组织结构　a.股骨； b.松质骨和密质骨微观结构； c.骨陷窝-骨小管结构

松质骨是骨重建最活跃的区域，也包含着两级不同尺度的孔隙结构，即骨小梁结构和骨陷窝-骨小管结构。人松质骨中骨小梁的直径约为 130 μm，骨小梁平均间距约为 1 000 μm。骨小梁结构的孔隙中充满了液体，主要为由红细胞、血小板和白细胞等组成的红骨髓。成骨细胞和破骨细胞通常贴附于骨小梁表面，前者可以分泌骨基质以促进骨形成，后者溶解骨矿物导致骨吸收。在这些骨小梁中同样具有更小一级的骨陷窝-骨小管系统[3]，甚至可以形成类似密质骨骨单位的结构。

骨重建主要由成骨细胞主导的骨形成过程及破骨细胞主导的骨吸收过程组成，阐明力学刺激如何传导到骨组织细胞并调控其生物学功能是骨力学领域要解决的核心问题。当人们活动身体时，来自肌肉的收缩力及重力会使骨组织发生变形，而作用于骨的外力传递至细胞通常有两种方式：骨基质的变形引起附着于其上的的细胞产生相应的应变；另外，外力作用下上述孔隙的体积改变，引起孔隙内液体的流动，进而在细胞表面产生流体剪切力（图 1）。在上述载荷的作用下，骨组织细胞会直接感受力学刺激而产生生物学响应；另外，骨内生化因子、营养供应、pH 值等生理参数也会在力学刺激下发生动态改变，从而进一步引起骨组织细胞对骨结构的改造[4-5]。本文将主要综述近年来骨内液体流动方面的相关研究进展和成果，并对未来的发展趋势加以分析和展望。

从 20 世纪 90 年代末开始，人们开始关注骨内孔隙中液体流动对骨内细胞的影响[6]，代表性的工作包括纽约城市学院的 Stephen C. Cowin 和 Sheldon Weinbaum。此后大量研究结果表明，在流体剪切力作用下，骨组织细胞会发生显著的生物学响应。例如，成骨细胞和骨细胞在施加稳定流或脉动流后，细胞中的一氧化氮水平快速增加[7]，脉动流还可在成骨细胞中引起前列腺素 E2（prostag-landin E2，PGE2）的释放[8]。由于钙离子是细胞内最重要的第二信使分子，参与众多的胞内信号通路，人们也通过实验研究了流体剪切力对骨组织细胞内钙响应的影响[9-10]。例如，有人发展了骨组织受载情况下在体成像技术，观察到了骨内流体剪切力作用下嵌入骨基质内部的骨细胞与骨表面细胞（成骨细胞或破骨细胞）的力致钙响应，发现骨细胞具有显著钙振荡现象[11]。

在相关研究方法和技术方面，近年来有非常显著的进展。在体外对骨组织细胞施加流体剪切力的实验中，通常会采用平板流动腔技术，该方法可以提供稳定流场。由于人体运动时骨所受的载荷是周期性的，也有研究在进行体外细胞实验时采用振荡流，以与生理条件更加接近。此外，人们还发展了一些其它的技术在体外模拟骨组织细胞的力学环境[12]。例如，有人将骨组织细胞培养在三维基质中模拟生理流体环境[13-16]。又如，微模式化技术被用于更精确地控制骨组织细胞的几何形状、相互之间的距离及连接方式，有研究表明细胞网络结构可以模拟骨陷窝-骨小管结构，从而可以更定量地研究细胞的信号传导途径[17-18]。

实际上，当前骨细胞力学领域的主要研究方向之一是细胞流体力学的体外实验，即应用流动腔、微流控等技术对骨组织细胞施加流体剪切力刺激并观察其生物学响应。有理由推测，在体情况下骨内间隙流可以有效地刺激在体骨组织细胞的生物学响应。但是受限于骨内液体流动的真实情况（如压力、剪切力、液体流动速度等）并未明确，难以提供在体骨内液体流动与骨组织细胞响应甚至骨形成之间相关的直接证据。如何证明体外实验中施加的液体流动条件能够真实反映在体骨组织细胞的力学环境，以及如何直接开展在体情况下的细胞力学实验，仍需进行更加深入的研究。

如前文所述，骨内的两级孔隙（血管通道与骨陷窝-骨小管系统）尺度差距为 2～3 个数量级，因此推测这两级孔隙结构内的压力可能也不同。在较大的血管通道中，有足够大的空间使液体通过扩散很快地释放压力，从而可以在较长时间内维持较低的压力。血管通道内的液体压力被认为与骨内毛细血管的压力相当（40～60 mm Hg），如果长时间保持在高于血压的压力水平会使骨组织缺乏氧气和营养。另一方面，骨陷窝-骨小管系统因其较小的孔隙导致液体压力较难释放，从而可能在相对较长的时间内保持在一个较高的压力水平。在骨陷窝-骨小管孔隙中产生的静水压力，其大小是骨组织轴向应力的 12%，比血管通道内压力高出近 40 倍[2]。

由于骨组织细胞通常位于骨内，难以使用无损的方法在体确定骨内细胞周围的压力。最近，有人发展了髓内压动力学的检测方法，即将股骨开洞，并探入压力传感器以实时检测髓内压的动态变化。进而他们使用电极对骨骼肌施加不同频率的电刺激，评估了肌肉收缩对髓内压和骨应变的影响[19]。此研究发现，髓内压与刺激频率之间呈非线性关系，2 Hz 时髓内压最大，为 14 mm Hg（1.8 kPa），而对所有频率骨应变都小于 8 με。在距离刺激位置较远的部分，未观察到髓内压和应变的变化。当 5 月龄大鼠受到幅值为 30 mm Hg（4.0 kPa）、频率为 2 Hz 的动态髓内压刺激，其成骨相关基因[如 Runt 相关转录因子 2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨桥素等]的表达依赖于加载时间，在加载 14 天后增加，而到 21 天后下降[20]。此项研究结果说明髓内压的动态变化与大鼠的成骨过程密切相关，由于压力变化通常会引起骨内液体的流动，也间接显示了液体流动与骨形成相关。

实际上，骨受到动态力学刺激时，细胞会同时受到压力和流体剪切力的作用，而体外实验中也不太容易将这两种力学刺激分割开来。例如流动腔实验中，人们通常只控制流体剪切力，但会忽略对于腔室中液体压力的控制。有一个研究设法将流体剪切力和静态或周期性水压分离，以观测各自对成骨细胞的影响[21]。该研究结果显示施加流体剪切力的同时施加水压刺激可以影响嘌呤能受体的信号通路以及肌动蛋白骨架的结构，而流体剪切力可独自影响 B 细胞核转录因子（nuclear factor-κB，NF-κB）的核转移。

由于孔隙结构不同位置处的压力梯度是驱动液体流动的主要影响因素，因此有必要基于多孔弹性理论、在体流体力学实验检测技术、流固耦合数值模拟方法等进一步深入研究骨内的压力分布以及动态变化特性，从而准确测量和评估骨组织细胞所受的流体力学微环境参数。

在 20 世纪 70 年代以前，人们并不认为力学载荷作用下骨内液体会发生明显的流动。实际上，骨细胞深埋于高度不渗透的骨基质中，其周围可供液体流动的空间很小，径向宽度不到 1 μm，同时骨细胞间连接的间距又很长（约 30 μm），甚至某些骨细胞与血管通道的距离可达到 200～300 μm。对于骨组织细胞特别是位于骨陷窝内的骨细胞来说，其生存及功能实现需要充足的营养液供应、自身分泌物的交换以及代谢废物的排放，而简单的分子扩散并不能满足这样的要求。一个合理的解释是力学刺激主导了骨陷窝里的液体流动，从而为骨细胞的生存提供了充足营养供应及代谢物排放途径。

目前骨内液体流动的在体检测技术主要基于染色剂的示踪灌注技术，例如利用双硫蓝（disul-phine blue）、普施安红（procion red）、过氧化物酶等。最近有人利用激光共聚焦显微镜结合荧光示踪技术，研究了不同分子量的荧光染料在骨膜处的渗透性，发现 40 kD 以下的染料都可渗透通过骨膜[22]。有人将异硫氰酸荧光素（fluorescein iso-thiocyanate，FITC）标记的牛血清白蛋白注入大鼠胫骨中，施加动态力学刺激后，利用激光共聚焦显微镜观察荧光染料在骨陷窝-骨小管系统中的运动，发现力学刺激作用下标记有示踪粒子的骨细胞个数增加，骨质疏松骨内其增加更为显著，说明骨质疏松会影响力学刺激下的骨内液体流动[23]。骨内的水主要呈现两种形态，即在孔隙内自由流动或结合在基质上，有学者利用1H 核磁共振技术测量了骨内两种形态水的比例，发现 70 岁以上人体骨内结合水少而自由水多，并且高体积比的自由水通常对应较低的骨强度，表明骨髓退化导致自由水体积增加[24]。

2005 年 Wang 等[25] 基于荧光漂白恢复（fluore-scence recovery after photobleaching，FRAP）技术发展了一项新的在体测量方法，从而可以实时获得骨陷窝-骨小管系统中的渗透率。他们构建了在体骨加载模型，然后使用激光共聚焦显微镜对骨膜内的密质骨成像，再使用一束高强激光使某个骨陷窝中的荧光染料淬灭，并实时测量了相邻骨陷窝或骨小管中液体重新扩散到此骨陷窝的动态过程，最后利用对流扩散方程计算渗透率。如果没有外载，则这种方法可以得到荧光染料的扩散系数，并确定胞外基质的孔隙尺度。通过这一技术，他们测量了不同的幅度、频率载荷下，骨内液体流动的扩散增强系数及溶质流速[26]。结果发现随着加载幅度的增加骨内的液体传输及溶质速度也相应增强，但是当加载频率增加时其液体传输在一定程度上减弱了。

由于骨细胞主要位于骨骼内部的骨陷窝中，导致很难观测在体情况下骨细胞周围的液体流动。即使前述的 FRAP 技术，也由于激光光束穿透深度有限而不易观察靠近骨髓腔特别是松质骨区域的液体流动。因此，未来有必要进一步发展新的技术手段，如可伸入骨骼内部的微探头、高分辨率超声成像、骨骼透明化处理等，从而可以更加准确地测量骨组织细胞周围的力学微环境。

受限于在体测量实验技术的缺乏，理论预测和数值模拟成为研究骨内液体流动的有效方法[27-28]。20 世纪 90 年代之前，骨内液体流动的理论模型都只考虑单一尺度的骨孔隙结构（骨单位或骨陷窝-骨小管结构），没有考虑不同尺度孔隙结构之间的相互影响。1999 年 Wang 等[29] 提出了一个计算模型，同时考虑了骨单位中的血管和骨陷窝系统中的液体流动，用来解释 Starkebaum 等在 1979 年实验观察到的准静态和动态加载时具有不同应变电势的现象，并且证明了骨内的液体流动主要通过血管通道来衰减。Wang 等研究结果的意义在于考虑到骨内两级孔隙结构的孔隙尺度并不相同，即血管通道比骨陷窝-骨小管系统大 2 到 3 个数量级，并证明了血管通道具有更低的压力，以及同时考虑两级孔隙结构对于准确计算动载作用下骨内液体流动的重要性。鉴于测量小尺度孔隙内的渗透率较为困难，最近 Benalla 等[30] 建立了一个新的理论模型并应用该模型对实验结果进行分析，可以准确地测量得到人密质骨内骨陷窝-骨小管系统的渗透率，其量级为 10–22 m2，且随载荷频率的增加而线性递减。

近些年来越来越多的研究使用真实骨结构代替理想的骨模型，并使用流固耦合数值模拟方法来评价骨内的液体流动[31]。2013 年 Birmingham 等[32] 构建了一个包含骨小梁孔隙结构的理想松质骨模型，使用流固耦合数值模拟方法计算了其中的液体流动、压力分布和流体剪切力。2015 年 Metzger 等[28] 使用微计算机断层扫描技术（microcomputed tomography，Micro-CT）扫描猪的股骨，通过三维重建得到其真实的松质骨几何模型。随后使用流固耦合数值模拟方法对该模型进行计算，研究了猪股骨部位真实松质骨骨小梁孔隙结构中的流体剪切力、压力分布和流速，并分析了骨髓的不同粘度系数对骨小梁孔隙液体流动的影响。他们的计算结果发现流体剪切力的峰值为 10 Pa，流体剪切力的峰值出现在狭窄区域的流-固交界面上。最近 Fan 等[33] 利用一段小鼠胫骨的 Micro-CT 图像构建了三维有限元模型，并采用双相多孔弹性模型来模拟骨的材料力学性质，数值模拟结果显示靠近髓腔的骨内孔隙流压力小于靠近骨膜侧。

Verbruggen 等[34] 为了评价骨陷窝-骨小管内液体的流动情况，通过对大鼠胫骨中段切片进行荧光染色，再使用荧光共聚焦显微镜扫描，经三维重构得到单个骨陷窝-骨小管的真实几何模型，然后使用流固耦合方法计算了单个骨陷窝-骨小管结构中的液体流动速度、骨细胞膜表面流体剪切力及细胞应变分布，并分析了骨细胞突触与骨小管壁连接造成的流体剪切力放大现象。计算得到骨陷窝-骨小管内流体剪切力的峰值约为 12 Pa，主要分布于骨细胞突触与小管连接处，且细胞膜表面流体剪切力均大于 0.8 Pa，高于细胞培养实验中可导致骨细胞响应的力学刺激阈值。Vaughan 等[35] 的另一工作通过对单个骨陷窝进行流固耦合数值计算，得到了骨陷窝内部骨细胞的应力、应变、流体剪切力的分布情况，讨论了骨细胞的原纤毛及整合素蛋白作为细胞力传感器的潜在可能性。与多孔介质理论比较，尽管这些数值模拟研究中所使用的边界条件还需进一步讨论，但它们能够更直观、更细致地反映骨内孔隙中的液体流动情况。

由于骨骼内部存在多级孔隙结构，例如密质骨内的哈弗氏系统和骨陷窝-骨小管系统或松质骨内的骨小梁结构和骨陷窝-骨小管结构等，外部载荷作用会引起骨基质变形，进而导致液体部分存在压力梯度，最终驱动液体发生流动。而液体流动会显著地影响骨组织细胞的生物学响应，并调控成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收过程，这也是目前骨生物力学领域公认的调控力致骨重建的主要机制。由本文综述的相关研究成果可以看出，近年来人们已经在理论、实验、数值模拟等不同方面取得了大量重要进展，对骨内液体流动的形式及其生物学作用的刻画也愈来愈清晰。尽管如此，该领域仍然存在一些重要问题尚未解决。

首先，尽管有许多研究通过理论建模试图阐明骨内液体流动的机制[25]，但是这些研究通常采用理想化的几何模型，并且对边界条件作了一定的简化，实际上这样的理论预测结果并不能精准地反映骨内液体流动情况。其次，在利用数值模拟方法来探索外力引起的骨内液体流动时，有的研究通过 Biot 渗流理论等多孔弹性介质模型来计算受外力作用时骨内的液体流速、压力梯度、流体剪切力等参数[7]，但是此种模型并不能反映真实的骨结构，不能准确获得骨内具体微观结构（如骨小梁、骨陷窝-骨小管系统）的局部液体流动信息。另外，有人使用流体动力学模型来数值模拟骨内液体流动，并将骨基质假设为刚体，其实并不能准确反映外力作用下骨组织变形导致的流-固耦合现象。近几年也有人使用流固耦合数值模拟方法计算了松质骨中骨小梁孔隙内和骨陷窝-骨小管内的流体剪切力[28, 32, 34-35]，但其所使用的边界条件的合理性仍需要进一步讨论，且这些研究中均未考虑不同尺度的孔隙结构之间的相互影响及其流体刺激的量级是否有差异。最后，作为骨重建最活跃的区域，松质骨越来越受到骨生物力学研究人员的关注，但与密质骨相关研究比较，松质骨内两级孔隙结构中液体流动的研究仍较少。因此，有必要在考虑流固耦合作用的条件下深入研究松质骨两级孔隙结构中的液体流动。

阐明骨内液体流动的具体形式及生物学调控机制，将促进人们对力致骨重建过程的深入理解，最终有助于解决长期卧床、废用及宇航员长期空间飞行等由于缺少力学刺激引起的骨流失甚至骨质疏松症等健康问题。

国家自然科学基金（11572043，11372043）