综述

2024-02-25 03:50| 来源: 网络整理| 查看: 265

编译：微科盟如风，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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导读

在微生物研究中，评估肠道微生物群落的“菌群失调”越来越被认为是一种常规分析，它为疾病和其他不良状况的预测和表征增加了相关信息。然而，菌群失调不是一个明确定义的条件。人们已经提出并应用了各种不同的菌群失调指数，但它们的基本方法、研究对象和研究条件存在很大差异。迄今为止，我们还没有关于这些指数的所有不同方法和应用的全面概述和比较。在此，我们列出了文献中确定的所有类型的菌群失调指数，介绍了它们的方法，将它们分类，并讨论了它们潜在的描述性和临床应用以及它们的局限性。因此，我们的重点不是菌群失调对疾病的影响，而是可用于确定和量化这种状况的方法论的方法。

论文ID

原名：Determining Gut Microbial Dysbiosis: a Review of Applied Indexes for Assessment of Intestinal Microbiota Imbalances

译名：确定肠道微生物失调:评价肠道微生物失衡的应用指标综述

期刊：Applied and Environmental Microbiology

IF：4.792

发表时间：2021.5.11

通讯作者：Tine Rask Licht

通讯作者单位：丹麦技术大学国家食品研究所

综述框架

主要内容

1 菌群失调的评估肠道微生物群的不平衡、功能失调或紊乱越来越被认为是某种疾病或不良健康状况的指标。由于微生物群落的复杂性和巨大的个体间差异，尽管许多研究用 "菌群失调 "一词来广泛提及它，但没有黄金标准来确定特定失衡或干扰的存在或程度。定义菌群失调的一个重要挑战是，由于健康人群中存在巨大的个体间差异，迄今为止还没有对健康肠道微生物群的明确定义。肠道微生物群的失调与许多不良状况有关，如艰难梭菌Clostridioides difficile感染（CDI）、代谢综合征、炎症性肠病（IBD）、结直肠癌、慢性肝炎、常见变异性免疫缺陷，甚至精神分裂症。在非肠道微生物群落中也观察到了菌群失调，如牙龈、口腔粘膜和唾液、头皮和前额。“菌群失调”一词的应用相当广泛，包括从单一物种的变化到整个微生物群落的扰动。为了限定菌群失调这一术语，人们已经定义和应用了几个指数。这些指数可能有助于描述疾病和不良状况、预测治疗结果，并提供除常用的α和β多样性评估以外的信息。大多数菌群失调指数是基于与作为参考的一组个体或样本的比较。即便如此，重要的是要强调，菌群失调不是一个定义明确的条件，菌群失调指数在方法论和临床背景方面有所不同，而且是在不同的人群中发展的，以描述各种不同的情况。我们最近综述了与临床背景下的微生物群评估有关的基本方法和原则。在本综述中，我们对目前应用的菌群失调指数进行了总结，并解释了它们在特定疾病和条件下的计算和性能。我们认为这对未来研究中选择和使用菌群失调指数非常有意义。然而，肠道菌群失调与人类健康之间的潜在因果关系并没有被任何一个菌群失调指数所涵盖，因此，不在本综述的范围之内。 2 菌群失调指数的类型2020年5月，我们在PubMed数据库的科学文献索引中搜索了搜索词“dysbiosis”或“disruption”、“score”或“index”的各种组合，以及所有搜索字段中的“gut”或“intestine”。我们评估了所有关于这些搜索中出现的肠道失调指数的定义和应用的既往研究。我们根据方法将确定的菌群失调指数分为五类，包括大规模细菌标记分析、基于分类群的相关方法、邻域分类、随机森林预测和α-β组合多样性（图1）。在可能的情况下，对某一方法的概括和扩展进行了描述。汇编了不同指数的详细概述（表1）。下面，我们从最普遍使用的指数开始，介绍这五类指数。

图1.层次图显示用于描述微生物群落失调的不同指数。最上面一层的数字指的是不同的指数。原始指数对应的是早期定义并普遍使用的指数。延伸表示从原始指数中衍生或概括出来的指数。表1.不同的指数来表征微生物群落的失调

第 1类:大规模细菌标记谱分析。大规模的细菌标记分析通过同时识别大量精心挑选的标志物种类或分类群来确定肠道微生物群的失调情况。这种类型的菌群失调测定可以用GA-map菌群失调检验作为例证，这是旨在确定和表征肠道菌群失调的几种商业产品之一。本产品的技术是基于一套针对16S rRNA基因（V3到V7）在不同细菌分类水平的探针，从而涵盖六个门水平的菌种，即Firmicutes厚壁菌，Proteobacteria变形菌，Bacteroidetes拟杆菌，Actinobacteria放线菌， Tenericutes软壁菌，Verrucomicrobia疣微菌，其中包括10个菌纲、36个菌属，超过300个菌种（图1，指数1.1）。GA-map菌群失调测试给每个样品打1到5分，其中大于2分表示微生物谱与选定的参考群体不同，因此被指定为 "菌群失调"，而2分或更低则被定义为 "正常菌群"，表示健康状态。此外，测试所针对的物种打分从-3到3，其中负值是指与参考种群相比丰度降低，正值表示丰度增加。样本和分类群的分数计算细节是专有的，不在公共领域提供。GA-map失调检验是根据668名成年人的样本开发的，包括健康对照组（n = 297），肠易激综合征（IBS）患者（n = 236）和患有炎症性肠病（IBD）的病人（n = 135）。该试验已在独立队列中得到验证，显示IBS中有73%的比例存在菌群失调，首次治疗IBD中有70%，缓解期IBD中有80%，健康个体中有16%。一般化和扩展。如上所述，GA-map失调检验最初被开发并验证用于IBD和IBS的诊断和预测。然而，研究还应用该测试评估其与各种干预措施的相关性，包括粪便微生物群移植或称FMT、饮食干预和抗肿瘤坏死因子（抗TNF）治疗溃疡性结肠炎（UC）的效果。据报道，FMT后GA-map指数评分降低，重复性FMT后进一步降低。此外，该指数还反映了肠道微生物对低可发酵低聚糖、双糖、单糖和多元醇（FODMAP）饮食的响应，这明显导致了菌群失调指数的增加。然而，其他报告发现低FODMAP饮食没有任何影响。Magnusson等研究表明，抗TNF治疗UC患者的效果部分取决于治疗前肠道菌群组成，无应答者的GA-map指数高于有应答者。另一项研究在考虑病态肥胖时评估了GA-map失调指数检测IBS的性能。比较了四组患有或不患有IBS和有或没有病态肥胖的受试者。与健康志愿者相比，无论IBS的情况如何，病态肥胖的受试者更容易发现菌群菌群失调。这强调了在使用GA-map失调检测时应考虑混杂因素。GA-map菌群失调测试也被应用于评估减肥手术后的干预措施效果、非营养性甜味剂、或NNSs、和原发性Sjögren's综合症，或PSS。在减肥干预和减肥手术后，菌群失调指数升高，并与NNSs的摄入呈正相关。此外，pSS患者的菌群失调比健康对照组更为普遍。GA-map失调试验中的一些指标具有特定应用。Farup等人调整了GA-map失调试验，从而创建了一个新的指标，称为替代指标（ADI）（指数1.2），它可以区分具有降糖和减肥作用的二甲双胍引起的微生物群紊乱和NNSs引起的微生物群紊乱，这可能导致葡萄糖的耐受不良。虽然ADI对这两种干预的反应是相反的，但未经修改的GA-map失调测试在两种情况下都产生了更高的分数。用于量化和预测IBS患者对4周FODMAP限制性饮食的反应，建立一个基于GA-map菌群菌群失调的特异性反应指数（RI）（指数1.3）。反应被定义为IBS严重程度评分降低大于50%。首先，确定应答者和无应答者之间差异的10个选定类群的应答者细菌中位数评分（源自GA-map失调试验），并将其定义为截断值，每个样本给每个类群一个点，如果丰富度较低的类群（应答者相对于非应答者）较截断值有更低的分数（应答者相对于非应答者）或丰富度较高的类群（应答者相对于非应答者）较截断值有更高的分数。每个样本的累加点数导致RI范围在1到10之间。因此，在区分和预测治疗结果方面，RI比GA-map失调试验更敏感，因为它被设计为只考虑应答者和非应答者之间的分类群差异。第2类:基于分类单元的相关方法。大量研究利用相关分类群建立了失调指数。这种指数只需要特定类群的丰度，由于其简单性，特别是在有测序数据时，已被广泛用于研究中。它们易于解释和可视化，通常基于丰度之间的比率、丰度之间的差异或基于丰度的线性回归进行计算。这里介绍的菌群失调指数都是基于相对丰度的；然而，其他类型的归一化也是可能的。在这些方法中，Gevers等人的方法是最早引入的，也是目前应用最广泛的方法（指数2.1）。目前已知，肠道微生物群落组成的改变与IBD的发病机制有关。为了量化和定义肠道微生物群与克罗恩病（CD）之间的关系，Gevers等人比较了来自大量乳糜泻受试者（n = 447）和健康对照组（n = 221）的回肠、直肠和粪便微生物。结果发现，在CD患者中，菌群丰富度整体下降，肠道微生物群组成发生改变。其中一组属与CD呈正相关，另一组属与CD呈负相关。在此基础上，作者开发了一个菌群失调指数（指数 2.1），定义为

该指数被发现与物种丰富度呈负相关，与CD严重程度呈正相关。一般化、扩展和变体。Gevers的菌群失调指数后来被修改，用于检测其他疾病和状况。在一项肝硬化研究中，Bajaj等人使用菌群的总相对丰度之间的比值，在以前的研究中发现，肝硬化患者菌群的相对丰度减少（毛螺菌Lachnospiraceae，瘤胃球菌Ruminococcaceae和梭菌ClostridialesXIV），并总结了先前确定的肝硬化相关细菌类群（肠杆菌Enterobacteriaceae和拟杆菌Bacteroidaceae）的相对丰度（指数2.2）。

指数值低表示菌群失调。据观察，健康对照组的指数高于肝硬化患者，并且与内毒素、死亡和器官衰竭呈负相关。在一项关于慢性乙型肝炎（CHB）的研究中，Wang等定义了菌群失调指数（指数2.3）为

因此，这类指数使用标准化的丰度差而不是丰度之间的比值来量化菌群失调。n是指在患病或健康状态下富集的细菌类群数量。指数值越大，说明菌群失调越严重。随后，作者应用Youden’s J统计量寻找最佳的指数值作为区分健康和慢性乙肝患者的诊断阈值。截断值设置为-25.36，因此，准确性、灵敏度和特异性分别达到0.77、0.75和0.81。类似的指数包括乘以100甚至是106。例如，Xia等将急性缺血性卒中的菌群失调指数（指数2.4）定义为

该指数是根据18个判别分类群计算的，它在训练队列中的AUC（接收者操作特征曲线下的面积）为0.749，验证队列中为0.843，这表明在区分卒中患者和对照组方面具有良好的能力。脑卒中患者的各项指标明显高于健康对照组。同样，一项对痛风患者的研究将痛风的微生物指数（指数2.5）定义为

利用Youden’sJ统计量将指数阈值设为22.157，超过阈值的指数表明患痛风的风险增加。该指数的AUC为0.817，用于诊断痛风个体。一些报告定义了更为复杂的菌群失调指数。为了建立一种指标来描述结直肠癌发展过程中的肿瘤负担，Nakatsu等设计了一个包含多个样本点的微生物群综合指数，如肿瘤（病例1），癌旁组织（病例2），腺瘤（病例3），腺瘤毗邻组织（病例4）。然后编制失调指数（指数2.6），以纳入所有病例的差异：

与这些复杂的方法相比，一些研究仅基于少数分类单元定义了一个菌群失调指数。例如，一项研究在线性回归中只包含了两个相关的类群，从而创建了一个失调指数。根据logistic回归分析，发现两种相关类群分别与复发性口疮（RAS）（约氏不动杆菌Acinetobacterjohnsonii）和RAS（唾液链球菌Streptococcussalivarius）无显著相关。然后将这两个物种的系数进行线性回归，定义菌群失调指数为5.35×[A. johnsonii]－0.309×[S. salivarius]，利用粘膜约氏不动杆菌A.johnsonii和唾液链球菌S. salivarius的相对丰度（指数2.7）。这个菌群失调指数正确预测了在被调查的队列中，83%的总病例存在或不存在RAS。更为简单的是，一些研究只使用两种菌门的比例，如厚壁菌门Firmicutes和拟杆菌门Bacteroidetes，来计算描述肠道微生物的指数（指数2.8）。这两个门共同构成了人类肠道细菌的大部分，它们分别代表革兰氏阳性和革兰氏阴性的种群。Jeffer等人应用厚壁菌Firmicutes -拟杆菌Bacteroidetes（F/B）比值成功区分了IBS患者的两个亚组（F/B高和F/B低）。分层为高F/B和低F/B比值允许识别IBS与健康对照中不同的肠道微生物，而这只在高F/B组中发现。Liu等人将F/B比值应用于肝硬化患者的研究，发现患者的F/B比值高于健康对照组。在心力衰竭（HF）患者中，微生物群的特征是F/B比降低和细菌多样性降低，这与临床结果相关。此外，F/B比率与肥胖有关；然而，这仍然存在争议。而大多数肠道失调指数是基于细菌群落的，Sokol等人将该指数定义为两个真菌门之间的丰度比，即担子菌门Basidiomycota和子囊菌门Ascomycota，因为这两个门在IBD、爆发性IBD （IBDf）、缓解期IBD （IBDr）和健康对照组的表型上表现出不同的丰度。此外，这两个真菌门之间呈现出很强的负相关关系（指数2.9）。该指数明显地区分了来自不同表型的样本，因为健康受试者得分显著低于IBD， IBDf，IBDr组和IBDf组得分显著高于IBDr个体。第3类:邻域分类。邻域分类是一种量化样本与参考样本集的偏差的方法，其依据是用距离或相似性矩阵评估微生物组成。因此，它已被用作测量特定个体与健康对照人群相比的菌群失调。通过其应用，Lloyd-Price等人将菌群失调得分定义为测试样本与健康参考群体（非IBD元基因组）之间的Bray-Curtis差异的中位数。该指数分别通过MetaPhlAn2和HUMAnN2计算工具从样本的分类或代谢组学组成中开发出来。这些工具包括内部归一化的总分类群或代谢物。为了确定一个样本是否存在菌群失调，定义非IBD样本中菌群失调评分的第90百分位为一个阈值。因此，测试样本高于阈值的中位距离值表明存在菌群失调。这种菌群失调指数被观察到在不同的疾病表型中有不同的分布（非IBD、UC和CD）。AlShawaqfeh等采用更为复杂的方法为慢性炎症性肠病（CE）犬引入了一种生态菌群指数（指数3.2），定义为

（样本与健康个体质心之间的欧式距离）-（样本与患病个体之间的欧式距离）

因此，该指数表达了特定微生物的样本与平均健康人群和疾病人群之间的距离差异。为了具体到疾病，欧氏距离的计算是基于通过定量PCR（qPCR）对七个精心挑选的分类群进行量化，这些分类群被证明与CE明显相关。指数为0表示样本与两个（健康和患病）群体的中心有相等的距离，指数高于0表示偏离正常健康状态。该指数在区分健康犬和CE犬方面达到了74%的灵敏度和95%的特异性。由于这种良好的表现，该指数用于众多以下研究，来量化患有CE的犬或猫的菌群失调、对食物的反应、驱虫治疗、FMT，以及高强度体力活动后的改变。 Montassier等人引入了一种名为“CLOUD”的测试来寻找给定微生物群样本中的异常值。虽然该测试不是直接用于衡量菌群失调，但使用log2转换的CLOUD统计量作为菌群失调评分（指数3.3）。类群丰度的归一化取决于用于确定CLOUD统计量的距离矩阵，这里使用了基于成对比几何均值（GMPR）的归一化。如果测试样品和健康参考集之间的CLOUD距离比健康参考集内的CLOUD距离平均值大两个标准差（SD），则认为该样品是失调的。CLOUD是一种非参数检验，对参考样本集的分布没有任何假设；因此，与健康对照相比，它可能有助于在不同条件下识别健康欠佳的微生物特征，或评估FMT后微生物群的恢复情况。第4类：随机森林预测。机器学习算法随机森林的输出结果（袋外概率，对自举法中遗漏的样本预测性能的内部估计），用来自小肠细菌过度生长（SIBO）患者和健康对照组的微生物群数据，已经被建议作为一种菌群失调指数（指定为“症状指数”）（指数4）。这个指数是基于由GMPR归一化的操作分类单位（OTU）丰度。该指数范围从0到1，其中接近1的值表示肠道微生物群来自有症状的患者的可能性很大。该指数成功区分了SIBO患者和健康对照组（AUC，0.896）。此外，该指数被观察到与特定的病人特征有关，如年龄和抗生素的使用。第5类：综合α和β多样性。α和β多样性已被常规用于基于测序的微生物群研究，并提供微生物群落的一般描述。α多样性用于描述微生物群落内独特分类群的数量（丰富性）和它们的分布（均匀性），通常被认为是健康的生物标志物，因为已知成年人的肠道细菌α多样性低与代谢健康相关的风险标志物有关。β多样性用于评估个体间微生物群落组成的差异，也常用于评估患者和健康对照之间的差异。最近，一项研究将α（Shannon指数）和β多样性（Jensen Shannon发散，或JSD）结合起来，为接受FMT治疗的艰难梭状芽孢杆菌Clostridioidesdifficile患者创建了一个菌群失调指。该菌群失调指数（指数5）被定义为（测试样品与每个供体之间的 Shannon 指数的平均差异）×（测试样本与每个供体之间的平均JSD）健康对照组的指数通常在0到1之间，而菌群失调患者的指数值大于1。这个指数在区分FMT前和FMT后的样本时，AUC达到0.922。 3 菌群失调指数的应用在此，我们回顾了现有的确定和量化菌群失调的方法，包括大规模的细菌标记分析、基于分类群的相关方法、邻域分类、随机森林预测、以及结合α和β多样性的方法。这些方法都成功地捕捉到了与疾病或干预的特定条件有关的微生物群与健康患者或基线（干预前）存在的微生物群之间的差异。大规模的细菌标记物分析测量一大组细菌标记物，以评估样本与健康对照组的分歧。GA-map菌群失调测试是专门为诊断IBD和IBS而设计的，已被广泛使用。然而，在使用这种测试时，需要考虑混杂因素，如肥胖，以避免误导结论。指数1.2和1.3代表了对GA-map菌群失调测试的修改，显示了为特定目的重新制定基本的GA-map菌群失调测试分数的潜力。以分类为基础的相关方法也被开发为疾病特异性的。因为相关的分类群在任何偏离的条件下都很容易被识别，它们很容易适应不同的疾病或条件。当有下一代测序数据时，如16S rRNA基因扩增子序列或宏基因组序列，基于相关分类群的方法是菌群失调指数的替代方案。虽然基于相关分类群的菌群失调指数2.1是在一个大样本集中开发的，随后在一个不同的CD患者队列中得到验证，并在其他研究中普遍使用，但其余指数的验证要少得多，通常是开发和利用它们所基于的同一数据集来解释的。因此，由于测序技术、统计分析、个体差异和混杂因素的不同，特定选择的相关类群在其他研究中可能并不有效。邻域分类法利用距离或差异矩阵来量化一个测试样本是否与一组健康对照组有明显的不同。指数3.1是利用距离矩阵的一个简单方法，即主观地选择一个距离阈值来区分失调和非失调样本。指数3.2以一种更为复杂的方式分别评估了检测样本与患病和健康样本组的接近程度。由于距离矩阵是基于7个精心选择的分类群而建立，指数3.2仅限于疾病CE，但将这种方法推广到其他情况仍有可能。指数 3.3是一个稳健的、非参数的离群检验，这使它成为许多不同条件下的合适指标。随机森林是使用机器学习技术处理大型复杂生物数据集的研究人员的热门选择，如肠道微生物群序列数据。指数4使用随机森林的原始袋外概率作为菌群失调指数，以量化测试样本和菌群失调样本的相似度。该指标不局限于某一特定疾病，可用于区分菌群失调样本与健康对照。然而，指数4基本上与随机森林对样本的二元分类相同，没有提供太多的额外信息，尽管连续的指数值可能与临床特征相关。α和β多样性的组合利用了常用的α和β多样性，并量化了来自患者和FMT供体的样本之间的差异。但这需要更多的验证，因为研究中对菌群失调和非菌群失调的定义没有明确界定。

结论

一些菌群失调指数已被成功应用于描述不同疾病或病症患者的肠道微生物群特征。它们可能在特定的疾病和治疗方面有重要的应用。

然而，必须强调的是，由特定指数测量的菌群失调的存在并不意味着菌群失调与特定疾病有任何因果关系。事实上，特定疾病或干预措施的微生物群改变往往是由饮食、药物、氧气供应或免疫反应等因素的改变造成的，在这种情况下，菌群失调指数可作为诊断标志，但不一定是预测工具。推断评估菌群失调的一般原则性的困难，在很大程度上是由于健康个体之间的巨大差异，导致缺乏对“正常”肠道微生物群的明确定义。事实上，表征特定疾病或干预的微生物群的改变往往是由于饮食、药物、氧气可用性或免疫反应等因素的改变而引起的，在这种情况下，菌群失调指数可作为诊断指标，但不一定是预测指标。人们很难推断评估菌群失调的一般原则，这在很大程度上归因于健康个体之间的巨大差异，导致人们缺乏对“正常”肠道微生物群的明确定义。事实上，微生物群的平衡是否会突然发生变化仍有待证实，并存在很大争议。需要注意的是，菌群失调指数不是独立的测量结局，必须结合临床结果来解释。尽管如此，作为描述肠道微生物群落复杂差异的简单工具，菌群失调指数的价值仍然存在。

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