痰液标本结核分支杆菌RNA恒温扩增检测及临床应用

王永忠，张宏宇，刘小琴，朱 珍，柳龙根，张 刚，屠文俊，韦生坤

(常州市第三人民医院，江苏常州213001)

目前结核病的实验室诊断主要包括痰涂片法、培养法、分子生物学方法、免疫学方法等［1］。近年来，以病原体RNA为扩增靶标的核酸恒温扩增检测(SAT)技术开始应用于病原体的核酸诊断。我们应用SAT技术对肺结核患者痰液标本中的结核分支杆菌(TB)RNA进行检测，并与PCR法检测TB DNA及痰培养、痰涂片抗酸染色直接镜检法检测TB的结果进行了比较。现将结果报告如下。

1．1 临床资料 选择2010年3月～2011年6月临床确诊为肺结核并接受治疗的住院患者131例，男85例、女46例，年龄(49．87 ±17．62)岁;73例非结核性肺部感染患者为同期本院呼吸科住院患者，男45 例、女28 例，年龄(45．71 ±16．9)岁。

1．2 标本采集及保存 痰液标本均为清晨收集，一部分直接做痰涂片抗酸染色，剩余标本取1．5 ml左右于5 ml离心管中，加入1～2倍体积的4%NaOH于无菌样品管中，旋涡振荡混匀，室温放置15～20 min。13 000 r/min离心5 min，弃上清，再加入1 ml生理盐水重悬洗涤，13 000 r/min离心5 min，弃上清。处理后标本可直接用于痰培养、SAT、PCR检测或－80℃冻存。

1．3 SAT检测 引物及探针序列:TB nT7:5'-gagtggcgaacgggtgagtaac-3'，TB T7:5'-aatttaatacgactcactatagggagacaccaacaagctgataggccgcgg-3'，TB Probe:5'-cgu ccggataggaccacgggacg-3'。RNA提取:液化处理后的痰液标本加入50 μl TB稀释液重悬后与50 μl阳性对照、50 μl阴性对照一起放入超声波处理器中进行超声处理，超声波功率为300 W，处理时间15 min。超声处理结束后的产物即可作为检测反应的模板。反应体系:将试剂平衡到室温(18～26℃)，充分混匀，按照每个样品取 28 μl TB 反应液和 2．0 μl TB检测液计算，配制所需扩增检测液，振荡混匀，3 000～4 000 r/min离心10 s备用。扩增检测:取 2 μl RNA模板加入含30 μl扩增检测液的微量反应管，置干热恒温器上60℃保温10 min，恒温混匀仪上42℃保温5 min，同时将SAT酶液也预热到42℃;在ABI 7500荧光定量PCR仪上设置恒温检测参数，荧光检测通道设定为FAM;42℃ 1 min，40个循环;荧光信号收集每分钟进行一次，共检测40次;向保持于42℃恒温混匀仪的微量反应管中加入10 μl已预热的酶液，盖上管盖1 200 r/min振荡15 s混匀，快速转至ABI 7500实时定量PCR仪，立即启动反应程序;根据CT值判断结果。

1．4 PCR检测TB DNA、痰培养法检测TB 采用深圳匹基生物和生物梅利埃提供的试剂盒或仪器，并严格按说明书操作。痰涂片抗酸染色法严格按照中国防痨协会“结核病诊断实验室检验规程”操作，采用齐—尼(Zield-Neehen)抗酸染色法进行痰标本处理、涂片、染色，按照镜检300个视野分级报告标准进行。

1．5 统计学方法 采用SPSS17．0统计软件，结果比较用配对χ2检验，灵敏度及特异度等指标比较采用χ2检验。P≤0．05为有统计学差异。

2．1 不同检测方法TB阳性检出率结果比较 131例肺结核患者痰液标本中，SAT法TB阳性检出率为52．67%(69/131);PCR法阳性检出率为50．38%(66/131);痰培养法阳性检出率为39．69%(52/131);痰涂片抗酸染色法阳性检出率为35．11%(46/131)。经χ2检验，SAT法检出率明显高于痰培养法(χ2=4．438，P=0．035)和痰涂片法(χ2=8．199，P=0．004)。73例非结核性肺部感染者四种方法均未检测到痰液标本中TB或其核酸的存在。

2．2 细菌学检测结果与核酸检测结果比较 131例肺结核患者痰液标本中，痰涂片及痰培养检测结果均为阴性的73例，SAT法检测出15例，PCR法检测出13例，见表1。

表1 细菌学与核酸检测结果

2．3 SAT法与PCR法检测结果比较 用PCR法检测结果作为参考标准，SAT法灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别是 95．38%、90．91%、91．18%、95．24%。二者符合率为 93．89%。对两种方法的检测结果进行配对χ2检验，差异无统计学意义(P=0．289)，结果见表 2。

表2 SAT法与PCR法检测结果

世界卫生组织统计数据显示，全球已有20亿人感染了TB，占全球人口三分之一，其中活动性肺结核患者达2 000万，TB的感染已经成为严重的公共卫生问题。建立早期、灵敏、准确、快速的检测方法对结核病的诊断、治疗和防控具有重要意义。

随着生物技术的快速发展，结核病的实验室诊断方法已经取得了一定的进展，传统的痰培养法需要3～8周，改进后的Bactec快速培养系统使培养时间缩短至15 d左右，但该方法只能检测出活力旺盛的菌，对活力差或死菌则无法检出［2］;痰涂片法受到标本取材、患者自身间断性的排菌、标本中菌的数量级大小等多种因素的影响导致其敏感度较低［3］;分子生物学方法在近年的TB检测中得到了长足发展，其中PCR技术发展较为迅速，它能快速、准确、灵敏地检出TB DNA，但成本和技术要求较高，易出现假阳性［4］;继PCR之后，又发展了几种新的核酸体外扩增技术，如Amplicor PCR、AMTDT等，它们都具有高度的灵敏性和准确性，但Amplicor PCR在操作上仍需进一步自动化以避免手工重复操作，AMTDT法能检测出无活力菌中的rRNA，不能用于监测化疗效果［5］。由于AMTDT不能鉴别 TB和MOTT，也不能进行药敏试验，因此不能代替传统的培养法［6］。

SAT技术具有高灵敏度和高准确性的优点，其技术原理是在同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸(RNA)的一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个(100～1 000个)RNA拷贝，每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环。同时，带有荧光标记的探针和这些RNA扩增子特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，从而实时反映扩增情况。本研究以SAT的16 s rRNA作为检测靶标，对131例肺结核患者痰液进行SAT，尽管由于接受结核治疗而使病原菌的活力及数量大大减少，SAT法仍能检出69例阳性痰液，检出率为52．67%，明显高于痰培养法的39．69%和痰涂片法的35．1%，非结核性肺部感染者用SAT未检测到痰液标本中TB核酸的存在，提示SAT应用于TB RNA的检测具有较高的灵敏度和特异性，可临床推广应用。

［1］赵雁林．结核病的实验室诊断方法［J］．中国社区医师，2008，24(1):10-11．

［2］王易伟，胡频频．rRNA扩增直接检测结核分枝杆菌的临床应用价值探讨［J］．中华检验医学杂志，2005，28(1):543-544．

［3］李强，陆其斌．影响痰涂片抗酸杆菌检出率的因素分析［J］．检验医学与临床，2011，8(1):64-65．

［4］Speers DJ．Clinical applications of molecular biology for infectious diseases［J］．Clin Biochem Rev，2006，27(1):39-51．

［5］Gamboa F，Manterold JM，Vinado B，et al．Direct detection of mycobacterium tuberculosis complex in nonrespiratory specimens by gen-probe amplified mycobacterium tuberculosis direct test［J］．J Clin Microbiol，1997，35(1):307-310．

［6］吴龙章，蔡杏珊，吴幸怡，等．四种检测方法对结核病临床诊断价值的探讨［J］．中华检验医学杂志，2007，30(7):742-745．