不同蛋白酶对香菇酶解液性质的影响

刘丽娜1，李顺峰1，魏书信1，崔国梅1，王安建1，田广瑞1，周美如2

（1.河南省农业科学院 农副产品加工研究中心，河南 郑州 450002；2.河南农业大学 食品科学技术学院，河南 郑州 450002）

摘 要：选用碱性蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶水解香菇粉，研究不同蛋白酶对香菇酶解液的水解度、营养成分、感官评价和挥发性风味物质的影响。结果表明，随着酶解时间的延长，三种酶解液的水解度先升高后降低，风味蛋白酶酶解4 h的酶解液水解度最高，达到26.03%；酶解液的可溶性蛋白质含量、多糖含量及鲜味和香菇特征风味在酶解过程中的变化趋势与水解度类似，其中碱性蛋白酶酶解液多糖含量较高、苦味最明显，风味蛋白酶酶解液可溶性蛋白质含量较高、苦味整体最弱，4 h的酶解液的整体感官评分最高，为22.80分。气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析三种蛋白酶解液共检出30种挥发性风味物质，其中含硫化合物相对含量占绝对优势，均高达90%以上，对风味的贡献最大；醛类物质种类最多，含量仅次于含硫化合物，其中风味蛋白酶解液中醛类物质相对含量最高。因此，风味蛋白酶酶解液水解度、营养成分更高，且整体风味更好。

关键词：香菇；蛋白酶；酶解液；风味

香菇是我国第一大食用菌生产品种，不仅肉质肥厚细嫩、滋味鲜美、香气独特，而且含有香菇多糖、有机碱、维生素、矿物质等生物活性成分，具有很高的营养、药用和保健价值，是一种食药同源的食品[1]。由于香菇含有丰富的呈味物质，具有独特的鲜美滋味，深受大众的喜爱，已成为天然调味料研发的热点。生物酶解技术是天然调味基料生产的常用方法，具有反应条件温和、耗能低、污染少、反应定向可控等诸多优点。采用酶解法对香菇进行加工，可以将原料蛋白质充分水解，释放更多的风味前体物质，使其特殊风味得到一定的增强。国内外关于菌类酶解的研究也有一些报道，如LI Q等[2]研究发现，蘑菇汤经过酶解预处理后蛋白质、氨基酸等成分显著增加；王雨生等[3]优化了超声波协同酶法制备香菇酶解液及其鲜味物质的工艺；沈文凤等[4-5]利用相应的酶解技术制备了香菇调味料，吴关威[6]研究发现，纤维素酶酶解法释放香菇柄中各滋味成分效果好于热水浸提法。这些研究主要集中于酶解工艺方面，对于不同蛋白酶酶解特性对比的研究较少。目前，常用的商业蛋白酶主要有中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶等，由于不同蛋白酶的作用位点不同，对酶解液的营养和风味有重要影响[3]，因此蛋白酶的选择对酶解液的性质至关重要。本研究采用碱性蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶对香菇粉进行单酶酶解，研究不同蛋白酶对香菇酶解液的水解度、营养成分、感官评价和挥发性风味物质的影响，为香菇调味料的开发利用提供技术依据。

香菇：购于西峡县孙氏菌业专业合作社，50 ℃烘干粉碎过80目筛，取筛下物密封保存备用；中性蛋白酶（酶活力0.8 AU/g）、碱性蛋白酶（酶活力2.4 AU/g）、风味蛋白酶（酶活力600 MG/g）：诺维信投资有限公司；甲醛、磷酸、乙醇、重蒸酚、浓硫酸、氢氧化钠、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、酚酞等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

YP30002电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；FA2004C分析天平：上海越平科学仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：河南省予华仪器有限公司；HN-1000Y超声波细胞破碎仪：上海汗诺轩仪器有限公司；SHZ-B水浴恒温振荡器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HC-3018高速冷冻离心机：安徽中科中加科学仪器有限公司；Advanced-I艾柯超纯水机：台湾艾柯成都康宁实验专用纯水设备厂；UV-1800型紫外可见分光光度计：济南海能仪器股份有限公司；GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；XB-20B多功能粉碎机：上海兆申科技有限公司；FE20 pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Supelco固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）手柄、50 μm DVB/CAR/PDMS萃取头：美国Supelco公司；Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）：美国Agilent公司。

1.3.1 香菇蛋白酶解液的制备

取适量香菇粉，按料液比1∶15（g∶mL）加入去离子水混合均匀，细胞破碎仪作用10min（超声功率800W、频率20kHz），分别添加一定量的蛋白酶，在一定条件下，酶解不同时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）后，沸水浴灭酶10 min后，4 000 r/min离心20 min，取上清液即为酶解液。通过预实验确定各蛋白酶作用条件分别为中性蛋白酶添加量0.7%、温度50 ℃、起始pH值自然，碱性蛋白酶添加量0.5%、温度50 ℃、pH 8.5，风味蛋白酶添加量0.7%、温度50 ℃、起始pH值自然。

1.3.2 测定方法

（1）水解度的测定[7]

采用甲醛滴定法对酶解液水解度进行测定，将酶解液4 000 r/min离心20 min，取上清液10 mL，蒸馏水60 mL于锥形瓶中，混匀，采用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液滴至pH=8.2，记下标准氢氧化钠溶液的体积，加入10 mL甲醛，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液滴定至pH=9.2，读取0.1 mol/L氢氧化钠溶液用量。同时，以蒸馏水代替待测样品做试剂空白实验。水解度计算公式如下：

式中：C为氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；V1为样液加入甲醛后滴定至终点所消耗氢氧化钠的体积，mL；V2为空白组加入甲醛后滴定至终点所消耗氢氧化钠的体积，mL；M为样品的质量，g；V为酶解上清液的体积，mL；8为每克蛋白质所含的肽键的毫摩尔数，mmol/g。

（2）可溶性蛋白质含量测定[8]

采用考马斯亮蓝G-250法对可溶性蛋白质含量进行测定。

（3）多糖含量的测定[8]

采用苯酚-硫酸法对多糖进行测定。

（4）感官评价

采用9分制对香菇酶解液从鲜味、苦味、香菇特征风味三个方面进行感官评定，随机编号，由5名有感官评定经验的评定人员按感官标准评分，最后评分取平均值，满分为27分，感官评分标准见表1。

表1 酶解液感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standards of hydrolysate

（5）挥发性风味物质分析[9]

SPME条件：取10 mL样液放入40 mL萃取瓶中，盖上瓶盖在60 ℃水浴搅拌中平衡20 min后，用萃取头吸附30 min，然后将萃取头插入气质联用仪的进样器中解吸5 min。

GC-MS条件：采用HP-5MS毛细色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氦气（He），流速1 mL/min，不分流，进样口温度230 ℃；程序升温起始温度35 ℃保持5 min，5 ℃/min升温至150 ℃，再以10 ℃/min的速率升至220 ℃保持2 min，检测器温度：280℃。电离方式为电子电离（electronicionization，EI）源，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，四极杆温度150 ℃，质谱接口温度250 ℃，质量扫描范围30～550 u。

不同的蛋白酶水解效果不同，与酶本身的性质和底物的特点均有关系[10]。由图1可知，经过三种蛋白酶酶解处理后，香菇酶解液的水解度整体变化趋势大致相同，酶解过程中随酶解时间的延长水解度先升高后降低，这可能是底物浓度不断下降和终产物对酶的抑制持续加强的缘故[11]。风味蛋白酶包含有内切蛋白酶和外切蛋白酶等多种蛋白酶，作用位点广泛，碱性蛋白酶和中性蛋白酶都是一种内切蛋白酶，其选择性相对风味蛋白酶低[12]，因此相同酶解时间条件下，风味蛋白酶大部分酶解过程中水解程度最高。碱性蛋白酶在3 h时率先达到最大水解度23.332%，之后趋于平稳，整体水解程度明显偏低；风味蛋白酶和中性蛋白酶在整个酶解过程中均保持相对较快的增加趋势，分别在4 h、5 h达到最大水解度26.031%、25.709%，二者相差不大，均能达到较好的水解效果。

图1 不同蛋白酶处理对香菇酶解液水解度的影响Fig.1 Effect of different proteases on hydrolysis degree of Lentinus edodes enzymatic hydrolysate

由图2可知，随着酶解时间的延长，不同酶处理的香菇酶解液可溶性蛋白质和多糖含量变化趋势基本相同，均是先不断增加再缓慢减少。香菇蛋白质经蛋白酶酶解处理后，生成小分子肽和氨基酸，可溶性蛋白质含量增加[13]；同时，香菇多糖在结构上易与蛋白质结合形成蛋白质多糖，经蛋白酶水解后，蛋白质多糖被拆散，多糖被释放出来，从而增加了多糖的含量[14]；因此，香菇酶解液可溶性蛋白质和多糖含量的变化与图1中水解度的变化趋势一致。且碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶的酶解液同样在酶解3 h、4 h、5 h的含量达到最大，其中风味蛋白酶4 h酶解液可溶性蛋白质含量最高，达到1.146 g/100 g；碱性蛋白酶3 h酶解液多糖含量最高，达到11.993 g/100 g。之后随着酶解时间的继续延长，可溶性蛋白质含量略有减少，这可能是因为长时间的加热，使得酶解液中的蛋白质变性的缘故[15]。在酶解相同时间时，风味蛋白酶大部分酶解过程中可溶性蛋白质含量高于中性蛋白酶和碱性蛋白酶，这与图1中水解度的变化相对应；而碱性蛋白酶在整个酶解过程中多糖含量始终保持最高，这可能与香菇多糖中部分碱溶性多糖在碱性反应条件下逐渐溶解出来有关[4]。

图2 不同蛋白酶处理对香菇酶解液可溶性蛋白质（A）及多糖（B）含量的影响Fig.2 Effect of different proteases on the contents of soluble protein (A)and polysaccharide (B) of Lentinus edodes enzymatic hydrolysate

由表2可知，三种香菇蛋白酶解液的鲜味和香菇特征风味都随着酶解时间的延长得到了加强，碱性蛋白酶酶解3 h后、风味蛋白酶酶解4 h后、中性蛋白酶酶解5 h后酶解液的鲜味和香菇特征风味均出现不同程度的下降，这与酶解液水解度的变化趋势类似，可能是因为不同的蛋白酶在酶解过程中产生不同分子质量的多肽，呈现出不同的感官风味；后期感官评分降低可能与酶解产生的富含疏水性氨基酸的低分子质量肽有关[16]。其中香菇特征风味感官评分方面风味蛋白酶和碱性蛋白酶最大值优于中性蛋白酶，鲜味感官评分方面风味蛋白酶和中性蛋白酶最大值优于碱性蛋白酶。三种香菇蛋白酶解液中，风味蛋白酶苦味整体最弱；碱性蛋白酶的苦味最明显，且随着酶解时间的延长苦味加重，这表明酶解不仅能产生较多的呈味物质，也会生成一些苦味物质，这与沈文凤等[17]的研究结果相一致。综合来看，风味蛋白酶酶解4 h时的酶解液感官评分最高，为22.80分；其次是中性蛋白酶酶解5 h的酶解液和碱性蛋白酶酶解3 h的酶解液，分别为22.10分、21.20分。

表2 不同蛋白酶处理的香菇酶解液感官评分结果Table 2 Sensory scoring results of Lentinus edodes enzymatic hydrolysate with different proteases

由于整个酶解过程中碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶的酶解液分别在3 h、4 h、5 h具有较高的水解度和感官评价，因此，进一步对其进行GC-MS分析，分离鉴定出的挥发性风味物质组成及相对含量见表3。

表3 不同蛋白酶处理的香菇酶解液挥发性风味物质GC-MS分析Table 3 Volatile flavor substances in Lentinus edodes enzymatic hydrolysate with different proteases by GC-MS

续表

由表3可知，香菇碱性蛋白酶解液共检测出22种挥发性风味物质，包括醇类1种（0.60%）、含硫化合物5种（91.37%）、醛类10种（4.81%）、其他化合物（酮类、呋喃、酯类等）6种（3.22%）；香菇风味蛋白酶解液共检测出25种挥发性风味物质，包括醇类3种（0.75%）、含硫化合物6种（91.25%）、醛类11种（5.64%）、其他化合物（酮类、烃类、呋喃等）5种（2.36%）；香菇中性蛋白酶解液共检测出24种挥发性风味物质，包括醇类1种（0.53%）、含硫化合物6种（91.33%）、醛类10种（5.02%）、其他化合物（酮类、烃类、酯类等）7种（3.12%）。很明显，其中含硫化合物含量最高，醛类物质种类最多。

许多研究表明[18-19]，含硫化合物是香菇特征香气成分的主要物质，是影响香菇特征风味的关键组分，尤其可作为干香菇的主导性香气物质。三种香菇蛋白酶解液中相同的挥发性风味物质共有19种，且含硫化合物的总相对含量占绝对优势，说明三种酶解液主要呈香物质种类含量差别不大，差别更多体现在调和风味的醛、酮、酯等物质的差异方面。本实验中所用原料为干香菇，文献中报道干香菇中含硫化合物达37.51%～62.09%[20-22]，而三种酶解液中含硫化合物含量均高达90%以上，对风味的贡献最大，说明香菇经酶解后能释放出更多的特征性风味物质。本实验在香菇酶解液中检测到的含硫化合物主要为1,2,4-三硫杂环戊烷、1,2,4,5-四硫杂环己烷、1,2,3,5,6-五硫杂环庚烷（香菇素），这类硫杂环类化合物香气强度大、香味阈值低、能有效改进和增强香味特征[23]。三种硫杂环类化合物总相对含量为碱性蛋白酶解液（86.58%）＞风味蛋白酶解液（86.49%）＞中性蛋白酶解液（83.39%），这与前面得到的香菇特征风味感官评分结果相一致。本实验中二甲基二硫醚和二甲基三硫醚在三种酶解液中均未检测出来，这可能与硫醚类物质在聚合反应中形成含硫杂环化合物（1,2,4-三硫杂环戊烷、1,2,4,5-四硫杂环己烷）有关[24]。

八碳化合物也是香菇风味成分的重要组成，代表性物质如1-辛烯-3醇、3-辛醇、3-辛酮等[25]，本实验仅检测到1-辛烯-3醇，且含量不高，说明酶解处理使1-辛烯-3醇含量下降，可能是由于其热稳定性较差，产生氧化分解导致含量降低[26]，这与杨肖等[27]的研究结果相一致。三种酶解液中醇类物质含量均不高，原因可能是醇类物质在加热时易挥发或易与酸类物质发生酯化反应。本次检测中醛类物质含量仅次于含硫化合物，其中风味蛋白酶相对含量最高，醛类物质具有青草的风味，主要包括己醛、苯甲醛、烯醛等，他们对气味起着补充调和的作用[28]。此外，三种酶解液的风味成分还有一部分来源于酯类、酮类、呋喃等化合物，本次实验中均有检测到，他们对整体香气有协调和互补的作用。所有这些挥发性风味物质共同构成香菇酶解液的特征风味。

本实验对不同蛋白酶的香菇酶解液的性质进行了比较分析，研究发现，三种酶解液的水解度随着酶解时间的增加先升高后慢慢降低，整体变化趋势大致相同，其中风味蛋白酶酶解4 h的酶解液水解度最高，达到26.031%；酶解液的可溶性蛋白质含量、多糖含量及鲜味和香菇特征风味在酶解过程中的变化与水解度类似，其中风味蛋白酶酶解液可溶性蛋白质含量较高、苦味整体最弱，碱性蛋白酶酶解液多糖含量较高、苦味最明显，风味蛋白酶酶解4 h的酶解液感官评分最高为22.80分；其次是中性蛋白酶酶解5 h的酶解液（22.10分）和碱性蛋白酶酶解3 h的酶解液（21.20分）。

采用GC-MS对挥发性风味物质进行分析，三种香菇酶解液中风味蛋白酶解液共检测出25种挥发性风味物质，高于碱性蛋白酶和中性蛋白酶；三种酶解液中含硫化合物总相对含量占绝对优势，均高达90%以上，对风味的贡献最大，说明香菇经酶解后能释放出更多的特征性风味物质。1,2,4-三硫杂环戊烷、1,2,4,5-四硫杂环己烷、1,2,3,5,6-五硫杂环庚烷这三种硫杂环类化合物总相对含量碱性蛋白酶解液（86.58%）＞风味蛋白酶解液（86.49%）＞中性蛋白酶解液（83.39%），与香菇特征风味感官评分结果相一致。三种酶解液中醛类物质种类最多，含量仅次于含硫化合物，其中风味蛋白酶解液中醛类物质相对含量最高。综合来看，风味蛋白酶香菇酶解液具有更高的水解度、可溶性蛋白质含量、多糖含量和更好的整体风味。

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Effects of different protease on the property of Lentinus edodes enzymatic hydrolysate

LIU Lina1,LI Shunfeng1,WEI Shuxin1,CUI Guomei1,WANG Anjian1,TIAN Guangrui1,ZHOU Meiru2(1.Research Center of Agricultural Products Processing,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China;2.College of Food Science and Technology,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

Abstract：Mushroom(Lentinus edodes)powder was hydrolyzed by alkaline protease,flavor protease and neutral protease,and the effects of different proteases on hydrolysis degree,nutrient components,sensory evaluation and volatile flavor substances of mushroom enzymatic hydrolysate were studied.The results showed that with the prolonging of hydrolysis time,the hydrolysis degree of the 3 kinds of hydrolysate increased first and then decreased.The hydrolysis degree of hydrolysate by flavor protease for 4 h was the highest,reaching 26.03%.The changing trend of soluble protein content,polysaccharide content,umami and characteristic flavor of mushroom during enzymatic hydrolysis were similar to the hydrolysis degree.Among them,the alkaline protease hydrolysate had higher polysaccharide content and most obvious bitterness.The flavor protease hydrolysate had higher soluble protein content and the weakest bitterness,and the overall sensory score of hydrolysate of 4 h was the highest,which was 22.80 points.A total of 30 volatile components in the 3 kinds of enzymatic hydrolysate were detected by GC-MS,among them,the relative content of sulfur compounds was absolutely dominant,and all of them reached more than 90%and contributed the most to flavor.Aldehydes had the most varieties and the contents were second only to that of sulfur compounds,and the relative content of aldehydes in flavor protease hydrolysate was the highest.Therefore,the flavor protease hydrolysate had higher hydrolysis degree,nutrient components and overall better flavor.

Key words：Lentinus edodes;protease;enzymatic hydrolysate;flavor

中图分类号：TS264.2

文章编号：0254-5071（2022）03-0152-06

doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2022.03.026

引文格式：刘丽娜，李顺峰，魏书信，等.不同蛋白酶对香菇酶解液性质的影响[J].中国酿造，2022，41（3）：152-157.

收稿日期：2021-09-02

修回日期：2021-10-29

基金项目：2020年河南省重大科技专项项目（201300110700）；2020年河南省中央引导地方科技发展专项（YDZX20204100003891）；2020年河南省重点科技攻关计划项目（202102110207）

作者简介：刘丽娜（1982-），女，助理研究员，硕士，研究方向为食用菌保鲜与加工。