微生物铬转化和抗性机制与生物修复研究进展

铬是一种过渡金属元素，位于元素周期表的第六副(ⅥB)族，原子序数为24。铬在自然界中稳定存在的化学形态主要是Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)。微量的Cr(Ⅲ)在人体中有降低血糖、降低胆固醇、促进氨基酸吸收等作用，但过量有毒[1]。Cr(Ⅵ)一般以CrO42-和Cr2O72-形式存在，难以吸附或沉淀，对生物体有较强的毒害作用。铬对生物体的毒害作用主要体现在以下四个方面[2]：(1) Cr(Ⅵ)具有强氧化性，对皮肤、眼睛、呼吸道等具有直接的腐蚀和刺激作用；(2) Cr(Ⅵ)进入细胞后被还原时会产生大量的活性氧，导致DNA损伤进而诱发畸变、癌变；(3) Cr(Ⅴ)和Cr(Ⅲ)与DNA的碱基和磷酸基团都有较强的亲和力，可与DNA形成Cr-DNA复合体干扰DNA的复制、转录；(4) 细胞内被还原的Cr(Ⅲ)可以与酶的羧基或巯基反应而导致酶的结构和活性发生变化。Cr(Ⅲ)容易形成难溶且易吸附和沉淀的氢氧化物和氧化物，较之Cr(Ⅵ)降低了生物有效性，起到了钝化的作用[3]。因而，将高毒的Cr(Ⅵ)还原成Cr(Ⅲ)是铬污染的修复方式之一，也使铬还原型微生物在铬污染修复方面具有较好的应用前景。

由于铬在电镀、鞣革、钢铁、汽车制造、木材加工等现代工业中应用广泛，使得封存在矿石中的铬在水体和土壤中大量积累[4]。我国目前有25家铬盐生产的企业，年产值超过30万t[5-6]。铬盐生产过程中积累的铬渣含量已超过600万t，而且以每年60万t的排放量在增加[5-6]。据统计，受铬污染的土壤已达1 250-1 500万t[6]。对铬污染的土壤和水体进行修复已刻不容缓。生物修复是铬污染的修复方式之一，具有廉价、环保等特点[7]。目前，细菌、霉菌、酵母菌等微生物生均被报道出有Cr(Ⅵ)的还原和抗性能力[8]。这些微生物长期处在铬污染环境中，进化出了相应的铬转化和抗性机制。本文旨在综述微生物对Cr(Ⅵ)的转化和抗性机制，并介绍了利用微生物技术进行铬污染修复的研究现状。

将高毒的Cr(Ⅵ)还原成Cr(Ⅲ)是微生物在铬酸盐环境中很重要的解毒机制之一(图 1)。目前，芽孢杆菌、(类)希瓦氏菌、大肠杆菌、产碱杆菌、放线菌、蓝细菌等细菌，酵母菌、霉菌等真菌都被发现有Cr(Ⅵ)还原能力[8-14]。微生物的Cr(Ⅵ)还原按微生物的需氧情况，可分为好氧还原和厌氧还原；按还原的空间位置，可分为胞外还原和胞内还原；按是否直接有酶的参与，可分为酶促还原和非酶促还原。

好氧还原一般可以分为胞外还原和胞内还原。胞外还原能将Cr(Ⅵ)抵挡在细胞外，避免了摄入和外排的能量消耗，也避免了DNA的损伤，而且被还原的Cr(Ⅲ)被细胞壁上的肽聚糖或胞外多聚物(EPS)吸附后还能帮助抵御不良环境的影响[2]。好氧胞外还原主要包括分泌到胞外的还原酶的酶促还原、细胞表面活性基团的化学还原、细胞膜偶联的酶促还原。分泌至胞外的铬酸盐还原酶已在酵母菌Candida utilis M20和Candida maltose RRI中被发现[15]。C. maltosa RRI的胞外铬酸盐还原酶利用NADH为电子供体还原Cr(Ⅵ)至Cr(Ⅲ)[9]。但是，这些胞外的铬酸盐还原酶还没有被分离和鉴定，有待进一步深入的研究。细胞壁上的表面活性基团如羧基、巯基、羟基、氨基、磷酸基团等可以与铬发生络合、还原、离子交换、吸附等反应起到解毒作用[3, 15]。在Thermus scotoductus SA-01中，细胞膜上的二氢硫辛酰胺脱氢酶也被报道可以使用NAD(P)H作为电子供体还原Cr(Ⅵ)，而且更偏向于使用NADH[8]。另外，在Bacillus sp. MSM1和Serratia proteamaculans CRB1中也发现了膜偶联的铬酸盐还原酶，但是还没有被进一步鉴定[8]。

胞内还原则主要依赖一些可溶性还原酶和不依赖酶的还原性物质[3]。胞内还原是好氧细菌进行Cr(Ⅵ)还原的主要方式之一。细胞内的还原主要由一些可溶性还原酶介导，而在这些可溶蛋白中又以黄素蛋白为主。黄素蛋白以FMN或FAD为辅基，参与电子传递时先将NAD(P)H上的电子转移到辅基上，再传递给Cr(Ⅵ)[16]。P. putida F1中的ChrR，Enterobacter coli AMS6中的YieF，Paracoccus denitrificans CCM 982中的FerB，Pseudomonas ambigua G-1中的NfsA等蛋白都是具有Cr(Ⅵ)还原功能的黄素蛋白(表 1)。而且，在其他细菌中这些蛋白的同源蛋白也都具有类似的Cr(Ⅵ)还原功能[2]。在这些还原酶中，ChrR和YieF研究得较为清楚。ChrR和YieF均是同源二聚体蛋白，都可以使用NAD(P)H作为电子供体[19]。但是，ChrR使用NADH做为电子供体时还原效率比使用NADPH更高，而YieF使用NADH和NADPH还原时没有差别[19]。ChrR还原Cr(Ⅵ)时分两步，先转移1个电子形成Cr(Ⅴ)，再转移2个电子还原成Cr(Ⅲ)[3, 9, 19]。Cr(Ⅴ)极不稳定，会被氧化成Cr(Ⅵ)，释放出1个电子。由Cr(Ⅵ)转变成Cr(Ⅴ)，再由Cr(Ⅴ)转变成Cr(Ⅵ)会形成一个小循环，这个循环的过程会生成大量的ROS[3, 9, 19]。YieF则是经过一步，直接转移4个电子，3个电子转移给Cr(Ⅵ)生成Cr(Ⅲ)，1个转移给O2生成ROS[3, 9, 19]。相对ChrR，YieF还原Cr(Ⅵ)产生的ROS少，对微生物解毒更有利。另外，ChrR和YieF的底物特异性也不一样。YieF除了可以还原Cr(Ⅵ)，还可以还原其他的高价态金属如V(Ⅴ)和Mo(Ⅵ)，但ChrR不能[19]。目前已被鉴定的铬酸盐还原酶主要在细胞内，详见表 1。但仍有很多高效铬酸盐还原菌中的胞内还原酶有待进一步的分离鉴定，如Pseudomonas sp. G1DM21、Providencia sp. UTDM314、Streptomyces griseus NCIM 2020[24]。

除了酶促的Cr(Ⅵ)还原，在细胞内微生物还可以利用一些还原性物质进行非酶促反应还原。如微生物在铬胁迫条件下诱导产生或细胞本底产生的抗坏血酸、谷胱甘肽、过氧化氢、半胱氨酸等都可以还原Cr(Ⅵ)，这些也是微生物对Cr(Ⅵ)的解毒反应[3, 25]。这些还原性的物质会随着细胞的代谢进入不同的细胞部位进行Cr(Ⅵ)还原，但一般还是以在胞内为主。

厌氧还原也可以分为胞外还原和胞内还原。目前已经报道的厌氧胞外还原主要由细胞膜介导。Cr(Ⅵ)可以代替O2作为最终的电子受体，Cr(Ⅵ)的还原可以伴随有机物的氧化和能量的产生[3]。厌氧的Cr(Ⅵ)还原酶最先在Enterobacter cloacae HO1中被发现[22]。Cr(Ⅵ)可作为细胞膜上Cytochrome c的最终电子受体[22]。随后，Shewanella oneidensis MR-1的细胞色素蛋白MtrC和OmcA也被报道可以还原Cr(Ⅵ)[23]。在S. oneidensis MR-1中NADH的电子在内膜上经过NADH脱氢酶、泛醌传递到CymA，再由CymA传递给内膜和外膜之间的MtrA，然后传递至外膜的MtrB。外膜上的MtrB则将电子传递给MtrC和OmcA，最终由MtrC和OmcA将电子传递给Cr(Ⅵ)[23, 26]。

此外，部分厌氧菌也可以进行细胞内的酶促还原。在厌氧细菌Desulfovibrio vulgaris ATCC 29579中，可溶性色素蛋白Cytochrome c3可以利用H2为电子供体还原Cr(Ⅵ)[21]。厌氧的非酶促还原主要在硫酸盐还原菌和铁还原菌中被报道。硫酸盐还原菌对Cr(Ⅵ)的还原可以分成2步。首先硫酸盐还原菌将SO42-还原成S2-，然后S2-或其生成的HS–、H2S再去还原Cr(Ⅵ)[8]。铁还原菌则是先将Fe3+还原成Fe2+，再由Fe2+还原Cr(Ⅵ)[8]。

微生物不仅能还原Cr(Ⅵ)，也在Cr(Ⅲ)的氧化过程中扮演重要的角色。Cr(Ⅲ)在环境中主要以Cr(OH)3沉淀或络合态形式存在。Cr(OH)3在pH 5.5-12.0条件下可溶性很低，而且其可溶态也容易与腐殖酸、Fe3+等物质形成配位键而被络合[27]。但在pH偏酸时，Cr(Ⅲ)的溶解度会上升[27]。因而在一般的环境中，Cr(Ⅲ)的可流动性和生物有效性都很低[27-28]。一些氧化剂如次氯酸、高锰酸钾、臭氧能将Cr(Ⅲ)大量氧化[29]。在环境中，Cr(Ⅲ)的氧化只能在有氧或微氧的条件下进行。目前在环境中被报道的Cr(Ⅲ)氧化主要由O2和MnO2介导。可溶性氧对Cr(Ⅲ)氧化在环境中基本上可以忽略不计[28]。土壤中MnO2对于Cr(Ⅲ)的氧化则受到可溶性Cr(Ⅲ)的浓度、pH、离子强度、锰氧化物的比表面积等因素的限制[28, 30]。目前还没有发现能够直接氧化Cr(Ⅲ)的微生物，但是由微生物产生的生物锰氧化物MnO2比表面积较大，氧化Cr(Ⅲ)的能力比化学合成的MnO2强[31-32]。Pseudomonas putida MnB1、Bacillus sp. SG-1、Bacillus sp. WH4等细菌均能氧化Mn(Ⅱ)，生成可以氧化Cr(Ⅲ)的生物锰氧化物[31-32]。Cr(Ⅲ)的氧化不利于铬污染的修复，因此控制Cr(Ⅲ)的迁移对环境修复也较为重要。就生物地球化学循环而言，Cr(Ⅲ)的氧化起着重要的作用。

由于CrO42-与和SO42-的结构比较相似，因此CrO42-可以通过SO42-通道进入细胞。细菌Salmonella typhimurium LT-2中，CrO42-可以与SO42-竞争SO42-转运蛋白[33]。Shewanella oneidensis MR-1、Pseudomonas putida F1、Cupriavidus metallidurans CH34中CrO42-的加入会导致SO42-代谢相关的基因上调[9]。酵母菌Saccharomyces cerevisiae W303-1A中，SO42-转运蛋白Sul1p/Sul2p参与CrO42-转运[34]。链孢霉菌Neurospora crassa 74-OR23-1A中，CrO42-的转运也与SO42-转运通道相关[35]。然而，在细菌Caulobacter crescentus CB15N中，加入CrO42-后SO42-通道相关的基因下调[36]。这暗示着有的细菌可以通过关闭SO42-的通道来抵抗CrO42- (图 1)。此外，CrO42-还可能通过钼酸盐、磷酸等盐阴离子通道进入细胞[9]。

细菌的Cr(Ⅵ)外排主要由ChrA通道蛋白承担(图 1)。大多数铬抗性细菌中都发现有ChrA的编码基因，而且chrA基因缺失后会导致Cr(Ⅵ)的抗性显著下降[9]。ChrA蛋白的外排功能已在Pseudomonas aeruginosa PAO1、Alcaligenes eutrophus AE104，Shewanella sp. ANA-3等细菌中被阐明[9]。P. aeruginosa PAO1中伴随着NADH的氧化，ChrA将胞内的CrO42-转运至胞外，该过程可以被能量抑制剂和SO42-抑制[37]。这表明，ChrA除了可以转运CrO42-，还可以转运SO42-，并且转运需要消耗能量。细菌中，ChrA的基因存在于染色体或质粒上，一般以CHR基因簇的形式存在(图 2)。Ochrobactrum tritici 5bvl1中的CHR基因簇chrBACF研究较为深入。其中，ChrB是一个负调控因子，在感应到CrO42-时上调，但对Cr(Ⅲ)和SO42-不敏感[38]。C. metallidurans CH34中pMOL28质粒上的ChrB，除了可以感应Cr(Ⅵ)，还可以感应Cr(Ⅲ)，并且感应的能力和SO42-的含量有关[9]。O. tritici 5bvl1和C. metallidurans CH34中的ChrC则都与超氧化物歧化酶(SOD)有相似的功能[9]。ChrE可能具有切开Cr与谷胱甘肽的复合物的功能[38]。ChrF、ChrI、ChrJ、ChrK、ChrL都与Cr(Ⅵ)的抗性相关，但具体的作用机制尚不清楚[38-40]。

子囊菌门、担子菌门、壶菌门、接合菌门的真菌中均发现了与ChrA同源的蛋白[41]。其中，子囊菌门的N. crassa 74-OR23-1A的CHR-1研究较为清楚。CHR-1基因在加入Cr(Ⅵ)后上调[41]。然而，突变或沉默CHR-1后Cr(Ⅵ)抗性反而上升，而且将含有该基因的载体转入酵母菌中反而导致酵母菌的细胞内积累更多的Cr(Ⅵ)[41]。推测CHR-1有摄取Cr(Ⅵ)的功能，可将Cr(Ⅵ)转入到液泡中然后再排出细胞外[9, 41]。

Cr(Ⅵ)进入细胞后会导致胞内产生氧化压力进而损伤细胞。微生物在长期的进化过程中，也产生了相应的机制去应对氧化压力。Enterobacter cloacae K12中的SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽、硫醇类化合物都能帮助抵抗氧化压力[42]。C. crescentus CB15N中加入Cr(Ⅵ)会诱导SOD、谷胱甘肽转移酶、铁氧还原蛋白、谷氧还原蛋白上调[42]。C. metallidurans CH34的pMOL28质粒上的ChrC和ChrE，也与抵抗细胞氧化压力有关[39, 42]。

Cr(Ⅵ)之所以能导致畸变、癌变，原因之一就是Cr(Ⅵ)进入细胞后产生的氧化压力导致DNA突变。微生物体内DNA修复相关的酶能减少DNA的突变，从而在一定程度上降低Cr(Ⅵ)对细胞的毒害作用。细菌S. oneidensis MR-1和Arthrobacter sp. FB24的蛋白质组和转录组研究结果显示，在Cr(Ⅵ)胁迫下与DNA重组、复制、修复相关的酶都有所上调[9]。这表明在Cr(Ⅵ)胁迫下，微生物需要调用很多机制来保持DNA的稳定。SOS修复系统相关的调控蛋白LexA和修复蛋白RecA在E. coli K12、C. crescentus CB15N、S. oneidensis MR-1等细菌中都与Cr(Ⅵ)抗性相关[9]。DNA修复相关的RecG，RuvB等基因也与Cr(Ⅵ)的抗性相关[9, 43-44]。

利用微生物进行Cr(Ⅵ)污染治理的原理是：(1) 通过微生物将高毒的Cr(Ⅵ)还原成低毒的Cr(Ⅲ)，Cr(Ⅲ)主要以Cr(OH)3沉淀或络合态存在，降低了铬的毒力、流动性和生物有效性；(2) 通过微生物的吸附减少环境中Cr的积累。目前国内外已经分离到多种对Cr(Ⅵ)具有还原能力的细菌，且有部分微生物已经投入到Cr(Ⅵ)污染环境的治理实验中。吴淑杭等利用混合菌液修复铬污染土壤，2 d后Cr(Ⅵ)的转化率为43%，10 d后Cr(Ⅵ)的转化率达75.3%[45]。苏长青等采用激活有Cr(Ⅵ)还原能力的土著微生物的方法，可在4 d内将土壤中280.0 mg/kg的Cr(Ⅵ)降至检出限以下[46]。本研究组在盆栽烟草土壤Cr(Ⅵ) (21.4 mg/kg)污染的修复研究中发现，施用铬还原菌Lysinibacillus fusiformis ZC1可降低烟草叶部中53.3%的铬含量，并显著增加烟草根茎叶的干重[47]。这些铬还原菌将土壤中的Cr(Ⅵ)迅速还原为Cr(Ⅲ)，降低铬的毒性，进而有效缓解Cr(Ⅵ)胁迫对植物生长的影响[47]。另外，本研究组分离的一株类希瓦氏菌Alishewanella sp. WH16-1不仅对Cr(Ⅵ)还原效果好，对Cd(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)也有很好的去除能力[12, 48]。该菌对多种重金属混合污染的地区有很好的应用前景。

虽然已有一些微生物应用于铬污染的修复。但是，在环境中大部分微生物的生存能力和代谢活性会受到很大的影响[25]。因而，近年来本研究团队开发了微生物包埋制剂和微生物胶囊制剂应用到铬污染的水体和土壤治理中。用聚乙烯醇和海藻酸钠包埋后的Rhizopus sp. LG04和Intrasporangium sp. Q5-1都有很好的去铬能力，而且具有稳定性强、可重复使用等特点[14, 49]。在铬污染的土壤中，L. fusiformis ZC1制成的微生物胶囊有很好的修复效果[50]。此外，很多基于细菌和真菌的生物反应器也在水体的污染治理中取得了很好的效果[51-52]。

随着越来越多的Cr(Ⅵ)还原酶被发现，遗传改造的微生物也可能在未来Cr(Ⅵ)污染修复的应用中发挥重要的作用[3, 25]，但需要保证环境安全。微生物技术针对土壤来说，是污染修复。针对水体来说，可以是部分污染转移。目前针对土壤中的铬污染，主要的手段还是以降低其生物有效性、将其在环境中钝化为主。因为重(类)金属都是以原子的形式存在，无法降解，而且也很难从环境中提取。此外，如果环境条件发生变化，还原态的Cr是可以氧化的。比如在酸性条件或有强氧化剂的条件下，Cr(Ⅲ)氧化可以发生。因此，控制Cr(Ⅲ)的迁移对环境修复也较为重要。由于单一的微生物修复很容易受到环境的限制，微生物-植物、微生物-化学、微生物-植物-化学的联合修复也是未来Cr(Ⅵ)污染修复的发展方向[53-55]。虽然利用微生物进行Cr(Ⅵ)污染的修复有很多的优势，但同时也面临很多挑战。如何根据不同的环境条件去选择合适的微生物？如何让微生物的转化和吸附能力持久稳定地发挥？如何将转化和吸附的铬从环境中提取？如何保持铬还原优势菌和土著微生物的平衡？如何进行潜在的生态风险的评估？这些都是在未来的Cr(Ⅵ)污染微生物修复中亟待解决的问题。