最新进展

研究工作进展：    2007-2008 年度  开展了许多原创性工作，在多个领域中都取得了可喜的成就，尤其在哺乳动物受精机理、表观遗传学、动物体细胞克隆、转基因动物、干细胞研究等方面进展显著。    1  、哺乳动物生殖生物学与生殖技术    负责人：旭日干  院士    主要研究人员：邵华、王志刚、关泽红、郭旭东、夏雅娟、邢万金、芒烈、段彪、刘东军、于海泉、仓明    I  、胚胎干细胞研究    (1) 建立包含有未生长卵子和成熟卵子基因组的二倍体小鼠孤雌胚胎干细胞系    我们发明了一套基于“ Zona-free  ”的生发泡移植技术程序。将 GV 期卵子的透明带去除，然后进行去核。去核 GV 期卵子经 PHA-P  与未生长卵子进行粘合，再经电脉冲刺激形成融合重构卵。本研究使用 383 枚 GV 期卵子共获得 64 枚来自未生长卵子的 MII  期卵子，再与体内成熟卵进行核移植形成新的重构卵。经激活处理后，获得 13 枚囊胚。从这 13 枚囊胚共分离得到 3 株孤雌胚胎干细胞系 (NF-pES)  。利用这些细胞系进行嵌合体实验，结果表明在心脏，脾脏，肾脏和骨髓等器官中都有嵌合存在。利用 NF-pES 细胞成功建立了肌肉损伤修复小鼠模型。该成果发表于“  Cell Biology International ”， 2007, 31(11):1336-1344 。    (2)  杂合孤雌胚胎干细胞系的建立    将小鼠第二次减数分裂中期 (MII)  卵子的纺锤体移植到另一枚卵子中，孤雌激活后排出两个极体，体外发育得到囊胚。将得到的囊胚种植到经丝裂霉素处理的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上。分离得到 3  株孤雌胚胎干细胞系，经检测属于胚胎干细胞。经嵌合体实验得到了可以进入生殖系的嵌合体小鼠。    II  、环境激素的生殖毒理研究    三氧化二砷是环境毒素之一，对机体的健康损害是全身性、多系统的，也是已被肯定的人类致癌源。在对 Hela  细胞培养时发现，当培养基中分别添加雌二醇、三氧化二砷、雌二醇拮抗剂 (500nM) ，三氧化二砷具有雌激素样效应， 1.0μM 是对 Hela  细胞生长影响的分界点。    采用宫颈黏液结晶法对不同浓度慢性砷暴露小鼠动情周期进行检查，结果显示不同浓度的三氧化二砷均使小鼠动情周期发生紊乱。动情周期的紊乱是反应性激素代谢失调的敏感指标，因此本研究初步证明砷具有影响机体内分泌的作用，当属环境内分泌干扰物。    采用等离子质谱方法检测了慢性砷暴露雌鼠血砷的变化，并通过  RT-PCR 的方法检测了慢性砷暴露雌鼠生殖器官子宫、卵巢 ERα 及 PRmRNA 的表达情况。随着血砷浓度增加， ERαmRNA  表达总体呈下降趋势；砷暴露各组子宫和卵巢的 ERαmRNA 表达显著降低，并与对照组之间差异显著 (P0.05) ；砷暴露各组睾丸 PRmRNA 与对照组比较表达增强，但总体变化同样差异不显著  (P>0.05) ；孕鼠子宫 ERαmRNA 表达随砷暴露浓度增高而增高， PRmRNA 表达随砷暴露浓度增高反而降低；孕鼠卵巢随着血砷浓度升高，  ERαmRNA 表达降低， PRmRNA 表达增强；小鼠胚胎 ERαmRNA 表达随着血砷浓度升高而增强，与对照组比较，差异显著 (P0.05) 。

III 、精卵质膜融合机理研究    绒山羊和绵羊 Izumo1 和 CD9 基因的克隆及其相互作用的初步研究    在精卵融合分子中，精子上的免疫球蛋白超家族 ( IgSF ) 新成员 Izumo1 和卵子上的四次跨膜蛋白超家族 ( TM4SF ) 成员 CD9 证明是精卵融合必需的分子。本研究克隆了绵羊和绒山羊的 Izumo1 基因组 DNA 和 cDNA 以及 CD9 的 cDNA ，绵羊 Izumo1 基因长 4600 bp ，绒山羊 Izumo1 基因长 4598 bp ，二者同源性高达 99.9% ，并与牛、鼠和人 Izumo1 基因高度同源。将绵羊和绒山羊的 Izumo1 DNA 和 cDNA 序列对比分析后发现羊 Izumo1 有多种选择性剪接形式，其中完整的开放阅读框 ( ORF ) 长 963 bp ，由 8 个外显子剪接而成，编码 320 个氨基酸的肽链。该肽链在 C 端有 1 个跨膜结构域，胞外有免疫球蛋白样结构域。绒山羊 Izumo1cDNA 具有 del 69 、 del 182 和 del 217 三种选择性剪接异构体；绵羊 Izumo1cDNA 具有 del 69 和 ins 30 两种选择性剪接异构体。所有这 4 种选择性剪接均是典型的 GT-AG 内含子剪接，但由于肽链中间缺失或者 C 端截短，它们都部分或全部失去了免疫球蛋白样结构域。对羊 Izumo1 的氨基酸序列进行生物信息学分析显示其在结构上与小鼠 Izumo1 相似， N 端有一个氨基酸 1-22 组成的信号肽、 C 末端有一个氨基酸 302-319 组成的跨膜区，中间有一个氨基酸 161-252 组成的免疫球蛋白结构域，并在其上有一个潜在的 N- 糖基化位点 ( N 205 ) 。绵羊和绒山羊 CD9 cDNA 克隆均得到 1123 bp 序列，包含一个 681 bp 的完整开放阅读框，编码 226 个氨基酸的肽链。该肽链具有典型的 4 次跨膜蛋白家族特征。一个 N- 糖基化位点 (N 50 ) 、 4 个跨膜区、两个胞外环和一个被公认为 4 次跨膜蛋白家族标志的 CCG 基序。绵羊和绒山羊 CD9 氨基酸序列有 99.1% 相同，并与牛、鼠和人的 CD9 高度同源。    通过大肠杆菌表达绵羊 CD9 和绒山羊 Izumo1 重组蛋白，并成功地制作了小鼠抗羊 Izumo1 腹水多克隆抗体。用自制的抗体进行免疫组化研究显示绒山羊的 Izumo1 蛋白存在于睾丸精子发生过程中减数分裂各期细胞中，定位于单倍体圆形精细胞的细胞核内，随着精细胞变形，在长形精子中形成窄条状分布，最终转位至成熟精子头部的赤道环上。 RNA 原位杂交结果显示绒山羊 Izumo1 基因在初级精母细胞中转录。 该成果发表于“ Reproduction in Domestic Animals ” ， 2009 。    IV 、动物转基因研究    (1) 转胰岛素样生长因子 I 基因绒山羊研究    以毛囊特异表达的启动子 pKAP6-1 、 pUHS 分别引导胰岛素样生长因子 (IGF1) 基因，以新霉素抗性基因和红色荧光蛋白基因作为双选择标记，构建成功 2 个毛囊细胞中特异性表达 IGF1 的表达载体。通过 PCR 和 RT-PCR 方法从绵羊总 DNA 和总 RNA 中分别扩增出角蛋白关联蛋白 6-1 基因 (KAP6-1) 启动子区序列和绵羊胰岛素样生长因子 (IGF1) 编码区 cDNA 序列，以 pMD19T 为克隆骨架构建成中间克隆载体 p19TKI 。将 CMV 启动子序列连接在 pDsRed2-1 表达框架的红色荧光蛋白报告基因 (Red2) 上游 KpnI+ SmaI 位点构成 pCDsRed2 ； pCDsRed2 经 EcoRI 酶切，与 p19TKI 的 KI 片段连接构成 IGF1 毛囊细胞特异表达的第一种载体 pCDsR-KI 。    以 PCR 方法从小鼠基因组 DNA 扩增出超高硫角蛋白基因 (UHS) 启动子区序列，与 pMD19T 、 IGF1 cDNA(SalI + SphI 酶切片段 ) 构建成中间克隆载体 p19TUI ； pCDsRed2 经 SacI+ EcoRI 酶切、 Klenow Fragment 补平 EcoRI 端，与 p19TUI 的 UI 片段 ( 经过 SacI+ SphI 酶切、 Klenow Fragment 补平 SphI 端 ) 连接构成毛囊细胞特异表达的第二种载体 pCDsR-UI 。    利用体外转染技术将此 2 个表达载体分别导入绒山羊胎儿成纤维细胞，通过 G418 筛选出稳定表达红色荧光蛋白的 2 种克隆细胞；以体细胞核移植技术制备绒山羊转基因克隆胚胎。在所得到的 31 枚囊胚中，表达红色荧光蛋白的囊胚数 17 枚，阳性率为 55% 。 该成果发表于“中国科 学”， 2008, 38(12): 1152-1159 。

(2) 利用 RNAi 抑制小鼠胎儿成纤维细胞中 FGF5 基因的表达    运用 RNA 干扰技术对 eGFP 转基因小鼠胎儿成纤维细胞中的 FGF5 基因进行了干扰。首先针对小鼠 FGF5 mRNA 的第 316-335bp 区域、第 499-518bp 区域和第 766-785bp 区域分别设计了发夹式 RNA 干扰片段，经合成和退火后，连接到 pSilencer 3.0-H1 载体上，再把 H1 和干扰片段一同酶切下来，并将带有 H1 启动子的干扰片段连接到红色荧光表达载体 pCDsR 上，分别命名为 pCDsR- shRNA316(VI) 、 pCDsR-shRNA499(VII) 、 pCDsR-shRNA766(VIII) 。用 SYBR GREENI 荧光定量 PCR 方法对转染了不同干扰载体的细胞 cDNA 进行检测。结果表明，小鼠 FGF5 mRNA 的第 766-785bp 区域不是有效干扰区域；第 316-335bp 区域和第 499-518bp 区域是有效干扰区域，其中第 499-518bp 区域是最合适的干扰区域。    V 、 mTOR 信号通路在细胞生长调控中的作用与机制     mTOR 是一种存在于哺乳动物细胞中的 Ser/Thr 激酶，可以汇聚和整合来自于营养、生长因子、能量和环境胁迫对细胞的刺激信号，进而调节细胞生长。 TOR 基因和 TSC2 基因在肿瘤细胞 SEG-1 中高表达；使用 mTOR 特异性抑制剂 RAD001 处理 SEG-1 细胞，结果显示 SEG-1 细胞对 RAD001 敏感； mTOR 抑制可引起 SEG-1 细胞周期阻滞，细胞形态发生改变，抑制细胞增殖甚至导致细胞死亡； mTOR 被抑制可强烈抑制其下游靶 S6 的磷酸化，同时还抑制 mTOR 、 S6K1 和 S6 基因的表达，且这些抑制效应都具有剂量依赖关系； TAE226 对 FAK 和 IGF-IR 的抑制导致了 mTOR 信号通路活性的强烈抑制，预示 FAK 可能是 mTOR 信号通路的调节因子。    本研究克隆了内蒙古白绒山羊 mTOR 基因约 8.6Kb 的全长 cDNA 及 S6K1 、 S6K2 、 S6 和 FAK 基因的部分 cDNA 片段，序列分析表明几个基因在进化上都是高度保守的。表达模式分析表明 mTOR 基因、 S6K1 基因和 S6K2 基因在脾、肾、睾丸和肌肉中都有表达，在肾中表达稍强，脾中稍弱； S6 基因在脾、睾丸和肌肉中都高表达； FAK 基因在脾、睾丸和肌肉中都有表达，在睾丸中稍弱一些。使用 mTOR 特异性抑制剂 CCI-779 处理内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞 (GFb) 。 GFb 对 CCI-779 敏感， CCI-779 对 GFb 具有细胞毒性。 CCI-779 处理可导致细胞生长抑制，在 24 小时内引起细胞死亡。 mTOR 抑制可引起 GFb 细胞周期阻滞，细胞骨架失去正常组织结构，形态发生明显改变。 CCI-779 微弱抑制 mTOR 的磷酸化，强烈抑制 S6 的磷酸化，同时还抑制 mTOR 、 Akt 、 S6K1 和 S6 基因的表达，并可引起 35KD Caspase-3 酶原量减少，且这些抑制均具有剂量依赖效应。 CCI-779 抑制 mTOR 信号通路的活性，抑制细胞增殖。 mTOR 被抑制不仅影响其下游 S6 的磷酸化，而且抑制 Akt 、 S6K1 和 S6 基因的表达，并可能具有诱导绒山羊胎儿成纤维细胞凋亡的作用。目前，已分别将山羊 mTOR 基因 cDNA 编码区 3' 端核苷酸序列、 S6K1 基因 cDNA 编码区核苷酸序列、 S6K2 基因 cDNA 编码区核苷酸序列、 FAK 基因 cDNA 编码区核苷酸序列申报国家专利。    VI 、 CDK2 在 HSV 复制及细胞增殖中的调控     疱疹病毒宿主广泛，引起人和许多动物多种多样的感染。疱疹病毒复制机理的研究对发展病毒与宿主细胞相互作用的理论、抗病毒药物的开发以减轻疱疹病毒对人类健康的威胁、减少牛业的巨大经济损失有重要意义。目前对于 HSV 等病毒复制所需 CDK 种类还不清楚。我们假设 CDK2 可能是 HSV 复制和重新激活的关键性启动因素。本研究以表达显性负突变体 CDK2(dn-CDK2) 的 HT29Tet-On dn-CDK2 细胞系、靶向 CyclinA 、 CyclinE 及 CDK2 的干扰 RNA 等多种措施抑制 CDK2 活性，研究 CDK2 在 HSV 复制中的作用。结果表明， HSV 在 CDK2 活性下降的 HT29Tet-On dn-CDK2 细胞中的增殖具有感染剂量依赖性； HSV 感染宿主细胞 6 小时后 CDK2 活性被诱导； HSV 增殖动力学分析表明在宿主细胞 CDK2 活性被诱导后， HSV 即进入了快速增殖阶段。这一发现首次直接证明了 CDK2 活性与 HSV 复制的关系。用微球菌核酸酶 (MCN) 消化进行的尝试性实验发现： HSV 感染 CDK2 下降细胞 5 小时后其基因组 DNA 仍以结构紧密的染色体形式存在， HSV 基因组的存在形式与宿主细胞 CDK2 活性有关。这一发现为进一步研究 CDK2 调控 HSV 基因转录的机制提供了线索。  2、体外受精和克隆技术影响胚胎发育和基因表达的机理研究    负责人：于海泉    主要研究人员：吴侠、李燕、岳永莉、辛鹏慧、王玲玲、李轲涵、奥旭东、白海栋    本课题从胚胎基因组整体范围以及发育相关基因的单基因位点系统研究了表观遗传修饰对体外受精和体细胞克隆胚胎发育的影响。 ① 首先对体外受精胚胎和体细胞克隆胚胎整体范围内基因组表观遗传修饰特性进行检测； ② 选择早期胚胎发育阶段中特异表达的基因，研究体外受精、核移植操作对重编程中早期胚胎单个基因座位上 DNA 甲基化和组蛋白修饰的改变，及其对于早期胚胎发育的影响，探讨体外受精和体细胞克隆体系对早期胚胎发育的影响。 ③ 通过药物处理改变体外胚胎的表观遗传特性，探讨提高体外受精和核移植技术效率的方法； ④ 利用实时定量 PCR 和免疫组织化学方法检测了组蛋白 3 特异性转移酶 SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3) 基因 mRNA 和蛋白质的动态变化，并利用 RNAi 技术研究了 SMYD3 基因在牛卵母细胞成熟、受精及早期胚胎发育中的作用。研究结果表明， ① 体外受精和核移植操作造成基因组整体范围不同的表观遗传修饰变化； ② 利用 TSA 处理后的卵母细胞胞质明显促进了供体核的表观遗传重编程， TSA 处理后的卵母细胞能促进孤雌胚胎和克隆胚胎的囊胚率， TSA 处理明显增加转基因体细胞的报告基因的表达，并能增加了表达外源基因囊胚的比率； ③ 核移植过程同样存在着单基因位点的重编程异常，单基因位点的 DNA 甲基化以及组蛋白修饰影响着基因的表达调控，并在不同来源的胚胎细胞中其表观遗传修饰特性不同； ④ SMYD3 可能通过激活胚胎从 2 细胞到囊胚发育中起关键作用的基因来调节发育，并且这种影响是在卵母细胞成熟晚期而非受精后建立的。    (1) 体外受精和核移植技术影响胚胎基因组整体范围的表观遗传特性    1) 牛卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎早期发育过程中组蛋白修饰存在动态变化     本研究探讨了组蛋白 H3 、 H4 不同甲基化 (H3K9me2 ， H3K4me3) 、乙酰化修饰位点 (H3K 9ac ， H3K 18ac 和 H4K 8ac 、 H4K5ac) 在牛卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎体外发育不同阶段的动态变化。卵母细胞成熟有其特异的组蛋白修饰动态转变，组蛋白乙酰化逐渐被去除；受精是组蛋白甲基化、乙酰化逐渐恢复的过程，且不同修饰位点有其自身的动态变化特点；在胚胎发育过程中维持了组蛋白乙酰化、甲基化修饰。在受精及胚胎发育过程中，相同组蛋白的不同位点有相似的变化模式 (H3K 9ac vs H3K 18ac ； H4K 8ac vs H4K5ac) ；功能相关的不同组蛋白修饰有其类似的动态变化 (H3K 9ac 、 H3K 18ac vs H3K4me3) ，并且组蛋白乙酰化在牛胚胎细胞核中的定位也可能与合子基因组激活有关 (H4K 8ac 、 H4K5ac) ；而且组蛋白修饰与 DNA 甲基化密切相关 (H3K9me2) 。    2) 牛体外受精胚胎与体细胞克隆胚胎发育过程中组蛋白修饰存在差异    间接免疫荧光技术显示，从原核期到 8- 细胞期，克隆胚胎与体外受精胚胎存在着明显的组蛋白乙酰化、甲基化修饰的差异。高水平的 H3K 9ac 、 H3K 18ac 、 H4K 5ac 、 H4K 8ac 、 H3K4me3 和 H3K9me2 存在于 8- 细胞期之前的各期克隆胚胎中，并且 H4K 5ac 和 H4K 8ac 在克隆胚胎细胞核中的定位与体外受精胚胎也存在明显差异。 8- 细胞期以后，除了 H3K9me2 ，其他组蛋白乙酰化、甲基化修饰的荧光强度及定位，在克隆胚胎都与体外受精胚胎类似。因此，克隆胚 8- 细胞前的发育阶段，存在着明显的组蛋白修饰异常，但当供体核基因组被激活，供体核组蛋白修饰经历较大程度的重编程，使得克隆胚胎与体外受精胚胎具有类似的组蛋白修饰模式。    3) 异种重构胚 1- 细胞期组蛋白乙酰化重编程的研究    利用荧光免疫化学方法检测了绒山羊 - 牛异种核移植胚胎 1- 细胞期组蛋白 H3K9 、 H3K18 和 H4K8 乙酰化的动态变化，并与牛同种核移植胚胎在 1- 细胞期组蛋白乙酰化的动态变化进行了比较。结果显示，两种重构胚具有一致的组蛋白乙酰化修饰模式，即供体核发生早期染色体凝集，组蛋白 H3K9 、 H3K18 去乙酰化；重构胚被激活，组蛋白 H3K9 、 H3K18 重新被乙酰化。而组蛋白 H4K8 却表现出不同的变化模式，即早期染色体凝集时仅发生部分的去乙酰化。同种与异种重构胚具有一致的组蛋白乙酰化修饰模式，说明牛卵母细胞对不同种属体细胞组蛋白乙酰化的重编程并没有差异。  (2) 表观遗传特性的改变对于胚胎发育的影响     1) TSA 处理卵母细胞影响克隆胚胎发育及表观遗传重编程    本试验使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂 (TSA) 处理卵母细胞，探讨其对卵母细胞组蛋白乙酰化、克隆胚胎发育及供体细胞染色质重编程的影响。结果表明卵母细胞成熟率与 TSA 浓度呈明显的剂量相关，药物处理后明显增加了卵母细胞组蛋白乙酰化水平。 TSA 处理后的卵母细胞既促进了孤雌胚胎的发育，也促进了克隆胚胎的发育，但是处理组与对照组囊胚细胞数没有明显差异。当供体细胞核发生早期染色体凝集时，对照和处理组 H3K 9ac 、 H3K 18ac 荧光信号消失；对照组供体染色体 H4K 8ac 明显减弱，处理组该位点乙酰化消失；体细胞核 H4K 5ac 信号在对照组卵母细胞中没有明显变化，处理组 H4K 5ac 信号明显减弱。当重构胚被激活时，所用组蛋白乙酰化信号迅速恢复。 TSA 处理的卵母细胞还明显增加了供体染色质的稳定性 (74.2% vs 39.6% ， P0.05) ，但使用 TSA 处理异种重构胚 24hr 后显著地降低了桑囊率 (4.79% vs 13.68% ， P0.05) ，与对照组之间均有显著差异 (P