真菌药物敏感试验方法学特点与规范化应用

作者 | 袁凯旋  叶龙  陈晓丽  陈卓曦  赵云虎 （广州，广东省人民医院/广东省医学科学院检验科）

       侵袭性真菌病发病率日益增加，真菌感染和耐药已成为重大的公共问题，也是临床医生面对的难题。然而，国内大多数临床实验室在真菌检测能力、真菌药敏试验等存在诸多薄弱环节，特别是对于何时或如何标准开展抗真菌药物敏感试验（Antifungal susceptibility testing, AFST）存在一定的困惑。为此，CLSI和EUCAST均对真菌药敏试验的方法学进行了严格限定。本篇旨在综述AFST的不同检测方法进展，阐述真菌药物敏感试验方法的特点，为临床真菌药物敏感试验的规范化开展提供参考。

01

AFST常用参考方法

①

肉汤稀释法

酵母菌微量肉汤稀释法：酵母菌药物敏感试验的实验室标准化不断更新完善，最终修订完善为当前的M27第四版本（M27-A4) [6] ，该标准涵盖了抗真菌药物的选择和制备，检测程序的实施和解释，以及引起侵袭性真菌感染的酵母药敏试验的质量控制要求，适用于大部分临床上分离的酵母菌和新生隐球菌。2020年出版的《酵母抗真菌药敏试验性能标准》（M60 Ed2） [7] ，则为M27提供了最新的最小抑菌浓度（MIC）、抑菌圈直径和质量控制程序。   

产孢丝状真菌微量肉汤稀释法：目前，标准参考方法主要溯源于《丝状真菌稀释法药物敏感试验的参考方法》（CLSI M38-A3） [10] 和《产孢丝状真菌肉汤稀释法》（EUCAST E.DEF 9.3.2） [11] ，2020年更新的《丝状真菌药物敏感试验标准》（CLSIM61-Ed2）则为临床和实验室标准协会抗真菌药敏试验文件M38和M51提供了最小抑制浓度折点和质量控制表。

②

纸片扩散法

       肉汤稀释法操作较为繁琐，费时费力，不适用于实验室的常规开展。为此，CLSI 推出了纸片扩散法药敏试验，包括《酵母菌纸片扩散法》（M44-A2) [13] 和《非皮肤来源丝状真菌纸片扩散法药物敏感试验标准》（M51-A） [14] 。就结果准确性而言，酵母菌优于丝状真菌，丝状真菌纸片扩散法结果和标准MIC检测结果变异较大，有待进一步优化。 真菌纸片扩散法目前只适用于念珠菌属和部分产孢丝状真菌，念珠菌和丝状真菌在培养基、孵育条件、操作方法均存在一定的差异，CLSI推荐使用MH琼脂添加2%葡萄糖和0.5mg/L的美兰，其中葡萄糖有利于真菌生长，美兰增加抑菌圈的清晰度，而对于丝状真菌可使用普通MH琼脂进行实验。

02

AFST相关商业化产品

①

E-test 真菌药敏试条

       E-test法是改良的 纸片扩散法 ，将预先制备的含梯度抗生素药物浓度的试纸条，可根据抑菌环大小可以读出相应药物的最小抑菌浓度。培养基同样采用 RPMI 1640加2%的葡萄糖和1.5%的琼脂糖，用MOPs调节pH到7.0， 适用于念珠菌、隐球菌和产孢丝状真菌 ，该方法操作简单，其研究认为结果与CLSI推荐的标准方法一致性较好。除此之外，梯度扩散法相对于纸片扩散法的一个优势是 能够肉眼直观获得MIC值 ，与微量肉汤法相比具有良好的一致性。但国产E-test说明书未见其对丝状真菌的评估数据和结果判读，试剂条昂贵，对曲霉的结果不易判读，且结果不稳定。

②

Sensititre® YeastOne™比色法真菌药敏板

       Sensititre YeastOne比色法为 肉汤稀释法 的改良，产品利用Alamar Blue指示剂，侦测培养基中真菌生长引起的氧化还原电势的改变，表现为指示剂的颜色从红色到蓝紫色的改变，从粉红色变为蓝紫色的孔中的药物浓度即判读为MIC值。药敏板 适用于念珠菌、隐球菌和曲霉属 的检测， 同时可检测9种药物，在室温下保质期较长 ，适合在很少进行检测的临床实验室使用。

③

ATB Fungus 3真菌药敏板

      该药敏板为 微量肉汤稀释法 的改良产品，将多个梯度浓度的抗真菌药物定量固定在培养孔中，然后加入一定浓度和一定量的菌液，培养24h（隐球菌培养48h），判读结果。该方法可测定氟康唑、5-氟胞嘧啶、两性霉素B、伏立康唑和伊曲康唑5种药物， 不依赖仪器 ，使用最广， 适用于念珠菌和隐球菌，不适用于丝状真菌 ，该方法结果和CLSI标准方法比较准确率为97.5%，和 EUCAST 方法比较准确率为94.3%，结果重复性99%。

④

曲霉耐药性筛选平板

       EUCAST最近开发了一种使用四孔琼脂筛选平板测定曲霉分离株的唑类耐药性的标准，该方法可将曲霉接种含唑类和不含唑类抗真菌药物的琼脂中，并在培养24~48h后肉眼观察是否有真菌生长， 操作方便 ，可在临床微生物学常规实验室中实施，并且已经验证 可以同时检测多达5个烟曲霉菌落 [21] 。

03

其他AFST检测方法

       一般来说，对于AFST检测方法可以分为表型检测和基因型检测，前者观测微生物在抗菌药物作用下的生长及形态变化，而后者是在DNA水平检测抗药基因及突变的形成。对于表型检测，新工具包括了质谱、流式细胞术、热量检测、荧光显微镜以及光学芯片检测等；基因型检测方法主要有分子质谱分析、多种基因型技术及转录组学分析等。随着技术的发展，微流控技术作为一种并行处理可以高通量地处理不同种类真菌，从而实现检测方法及程序的改良。

【参考文献】

[6]Clinical and Laboratory Standards Institute. 2017. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts, 4th ed. Approved standard M27. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.

[7]CLSI. Performance Standards for Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. 2nd ed. CLSI supplement M60. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2020.

[10]Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi; Approved Standard. CLSI Document M38-A2.[J]. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA 2017.

[11]Arendrup M C, Cuenca-Estrella M , Lass-Flörl C, et al. Howard, the Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing (AFST) of the ESCMID European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). 2020. EUCAST defifinitive document E.DEF 9.3.2. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for conidia forming moulds.

[13]Clinical and Laboratory Standards Institute. Method for Antifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Guideline-Second Edition. CLSI document M44- A2.[J]. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA 2009.

[14]CLSI. Method for Antifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing of Nondermatophyte Filamentous Fungi; Approved Guideline. CLSI document M51-A. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2010

[21]Guinea J , Verweij P E , Meletiadis J , et al. How to: EUCAST recommendations on the screening procedure E.Def 10.1 for the detection of azole resistance in Aspergillus fumigatus isolates using four-well azole-containing agar plates[J]. Clinical Microbiology and Infection, 2019, 25( 6): 681-687.

-End-     编辑 | 骆秉涵 王迪