植物叶绿素荧光诱导动力学曲线

最近在帮师门同学做植物荧光的实验，也是相当冷门了，用大白话总结了一些学习的知识，图片上传还不成功，回头整理。

补充一点高中的生物与化学知识：

【氧化还原反应】狭义的氧化反应指物质与氧化合；还原反应指物质失去氧的作用。广义上来说，失电子为氧化反应，得电子为还原反应。有机物反应时把有机物引入氧或脱去氢的作用叫氧化；引入氢或失去氧的作用叫还原。还原剂是在氧化还原反应里，失去电子的物质。对于同一种元素的一个电对来说，高价态是是氧化态，低价态的是还原态。**

【光合作用】如下图所示，分为光反应和暗反应阶段，总表达式为:12H2O + 6CO2 ====> C6H12O6 + 6O2 + 6H2O

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【光反应与暗反应】

①场所：光反应在叶绿体基粒片层膜上，暗反应在叶绿体的基质中

②条件：光反应需要光、叶绿素等色素、酶,暗反应需要许多有关的酶。

③物质变化：光反应发生水的光解和ATP的形成，暗反应发生CO2的固定和C3化合物的还原。

④能量变化：光反应中光能→ATP中活跃的化学能，在暗反应中ATP中活跃的化学能→CH2O中稳定的化学能。

⑤联系：光反应产物[H]是暗反应中CO2的还原剂，ATP为暗反应的进行提供了能量，暗反应产生的ADP和Pi为光反应形成ATP提供了原料。

【光反应结构路线图】

[图片上传失败...(image-caa35a-1651938244691)] 光合作用高效的吸能、传能、转能过程是在光合膜上具有一定分子排列空间构象的色素蛋白复合体上进行的，并在10-15秒至10-7秒内完成。整合于光合膜上的色素蛋白复合物根据功能通常分为：光系统I（PSI）、光系统II（PSII）、Cytb6f复合物以及ATP合成酶复合物。在这4个色素蛋白复合体共同参与下，光合作用的光反应完成电子从H2O到NADP+的传递并产生ATP和释放O2。PSI和PSII是生物光能转换的重要场所，涉及水裂解放氧反应和原初电荷分离等关键步骤，是决定光合作用效率的重要部位。【引自网页https://www.chem17.com/tech_news/detail/2760204.html】

光系统II（PSII）是类囊体膜中的一种光合作用单位，由外周捕光(天线)色素蛋白复合体(LHCII)、内周捕光(天线)色素蛋白复合体(CP43和CP47等) 、反应中心色素蛋白复合体(PSII-RC)和锰簇合物，以及外周蛋白33kDa和17kDa等组成。PSII-RC由D1蛋白，D2蛋白，细胞色素b559(Cyt b559)的α亚基和β亚基以及Psb I基因产物五种蛋白质及其结合的叶绿素a(Chl-a)、脱镁叶绿素(Pheo)和β-类胡萝卜素(Car)组成。在一个PSII-RC中，只有两个Chl-a具有光敏化性质，它们组成特殊的“分子对”，在光催化的原初光化学反应中起着原初电子供体的作用，而它们的原初电子受体为Pheo。由于这一特殊的“Chl-a 分子对”在其氧化还原吸收光谱的680 nm 处有一明显的高峰，故称为P680 。PSII行使功能的前提是吸收光能，PSII将LCHII吸收的光能传递给PSII反应中心，使中心色素产生一个高能电子，并传递给原初电子受体。这一过程产生了带正电荷的供体（P680+）和一个带负电荷的原初电子受体（Pheo-），这一对相反带电性物质的形成非常重要，它们能够引发进一步的反应。因为P680+可以作为氧化剂，接受电子，引发水的光解，导致水氧化释放的电子向PSII的传递； 而Pheo-可以作为还原剂，丢失一个电子，引起电子向质体醌的传递，转移到质体醌的电子最终用于将NADP+还原成NADPH或用于非循环光合磷酸化。【引自网页https://www.chem17.com/tech_news/detail/2760204.html】

植物的光合 机构包括光系统 II (PSII)和光系统 I (PSI)，植物 被照光后，PSII 的捕光色素将捕获的光量子传递 给反应中心(P680)，使 P680 受激发处于第一激发单 线态(P680 * )，P680 * 很不稳定，将受激发产生的电 子传递给 P680 受体侧的去镁叶绿素(Pheo)，生成 P680 + Pheo- ，然后 Pheo- 将电子传递给 PSII 的电子 受体：初级醌受体(QA)、次级醌受体(QB)及质体 醌(PQ)等，最后经质兰素(PC)传递到 PSI 的反应 中心(P700)，生成的 P680 + 可以从 P680 的供体侧夺取 电子，并最终导致 H2O 的裂解。与 P680 一样，P700 受光激发后，生成 P700 * ，P700 * 将受激发产生的电 子传递给铁氧还蛋白，生成 P700 + ，并最终由铁氧 还蛋白 -NADP+ 还原酶把 NADP+ 还原为 NADPH， 用于光合碳的还原，P700 + 又可以接受从 PSII 传来 的电子，形成可持续的电子传递。电子传递的过 程伴随着质子的传递和跨膜质子梯度的生成，并 最终偶联 ATP 的生成。【引自论文-快速叶绿素荧光诱导动力学分析在光合作用研究中的应用】

大白话总结一下以上引文的含义：植物的光合作用分为光反应和暗反应，光反应的主要任务是分解水，而暗反应的主要任务是固定碳，前者为后者的发生提供了H+、催化酶。PSII作为植物光合器官结构的其中一个组成部分，主要在光反应中发挥作用，PSII有一个结构叫反应中心，是一个包含了很多色素的蛋白复合体，而这个反应中心里，只有两个Chl-a具有光敏化性质，这一对分子很重要，被称为P680，这个物质（P680+）就相当于氧化剂一样夺取电子，引发水的电解，因此在PSII中的光合作用阶段可以简单概括为：2H2O ===> O2 + 4H+ + 4e-。夺取到手的电子需要传递出去，进行下一步反应。电子在PSII内的传递路径为：P680+从水中夺电子变成P680，传递给 Pheo，Pheo变成Pheo-，Pheo-传递给QA，QA变成QA-，QA-传递给QB，QB变成QB-，最后传递给PQ（这里只解释了“一道电门”），此时就已经离开了PSII结构，此时还会经过一个中间结构，叫做Cytb6f复合物，也会有一系列反应，直至最终电子到达了PSI，被PSI的P700+给夺取，P700+变成P700，最后NADP+ + e- + H+ → NADPH（NADPH为暗反应做准备），至此完成了一个电子的从PSII到PSI的传递路径，这个电子传播路径很重要，因为这个路径中每一环节的时间是不一样的，而这个时间差，正是光抑制现象与Kautsky效应产生的条件。

【光抑制】植物的光合机构所接受的光能超过光合作用所能利用的数量时，光合功能便降低， 这就是所谓的光合作用的光抑制。 阴生植物被转移到强光下几分钟之内便可以发生光抑制。

【Kautsky效应】将暗适应的绿色植物或含有叶绿素的部分组织突然暴露在可见光下之后就会观察到，植物绿色组织发出一种强度不断变化的暗红色荧光，荧光随时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。这一现象最早是由 Kautsky 发现的，因此也称为Kautsky效应。

这两个名词实际上描述的是同一个反应的不同表现。事实上，在上一小节中描述的电子传递发生的同时，还有一部分能量以热和荧光的形式耗散掉。这三者之间是互相竞争的关系，任何一者的改变都会导致其它二者发生变化，也就是说：

植物吸收的总光能=植物光合作用消耗的光能+热耗散+荧光

通常还会假设荧光与耗散的总能量（热耗散+荧光）近似成正比，假设是比例系数为k，则上面的等式变为：

植物吸收的总光能=植物光合作用消耗的光能+k荧光*

这个等式很重要，因为它将荧光与光合作用联系起来，即，在同样的光强下，荧光越强，则反映出此时植物的光合作用能力越弱。【光抑制】描述的正是光合作用的能力变弱，【Kautsky效应】描述的正是植物发散的荧光变强。

注意到【光抑制】和【Kautsky效应】发生的一个共同条件——植物从暗光被移动到强光下，这种光源的变化是如何影响光合作用的过程，从而使得【光抑制】和【Kautsky效应】现象的发生呢？

植物绿色器官在经充分暗适应后，PSII 的电 子受体：QA、QB 及 PQ 等均完全失去电子而被氧 化(Krause和Weis 1991; Strasser等1995)。这时的PSII受体侧接受电子的能力最大，PSII 反应中心可 最大限度地接受光量子，即处于“完全开放”状 态，此时样品受光后发射的荧光最小，处于初始 相“O”(Fo)。当对样品照以强光时，PSII 反应 中心被激发后产生的电子经由 Pheo 传给 QA，将 其还原，生成 QA - 。此时，由于 QB 不能及时从 QA - 接受电子将它氧化[P680 * → Pheo- 需要 3 ps，Pheo- → QA 需要 250~300 ps，而 QA - → QB 需要 100~200 µs (Krause 和 Weis 1991)]，造成 QA - 的大量积累， 荧光迅速上升至 J 点(Govi- ndjee 1995; Strasser 等 1995, 2000, 2004)。QB 能够从 QA - 接受电子，形成 QB 2- ，导致 QA 和 Pheo 完全进入还原状态。此时 PSII 反应中心完全关闭，不再接受光量子，荧光产量最高，出现 P 点。在电子从 QA - 向 QB 传递过 程中出现的 I 点(图 1B) 反映了 P Q 库的异质性 (Strasser 等 1995; Govindjee 1995)，即电子传递过 程中快还原型 PQ 库先被完全还原(J-I)，随后才是 慢还原型 PQ 库被还原(I-P)。但是，也有学者不 认同这种观点，而且目前对于I-P荧光上升的过程 还存在其它一些解释，所以I点出现的原因需要进 一步研究。【引自论文-快速叶绿素荧光诱导动力学分析在光合作用研究中的应用】

大白话总结一下以上引文的含义：在昏暗的环境下，光能很弱或者没有，也就意味着此时植被光合作用的光反应阶段中的PSII中的：2H2O ===> O2 + 4H+ + 4e-反应过程很弱，根据前文的电子传递路径可知，此时有大量的滞留的P680+，这些P680+对电子求之若渴，植物被强光照射，这些P680+就会迅速开始夺取电子，但是前文也提到过，电子传递路径每一个环节的传递速度是不一致的，在这个环节【QA-传递给QB】，速度非常慢，以至于大量的QA-被滞留堆积，正是由于这种堆积，使得荧光迅速上升，并到达一个特征点，我们称之为J点。而由于QB-能够保持非常长的生存时间，能够继续从QA-处夺取电子，变为QB2-，这两个电子被薄膜中的PQ给夺走，结合两个H+变为PQH2（这是第二道电门），至此电子被传播离开PSII。具体J点之后I点和P点出现的原因，笔者还未能很好理解（似乎与这两道电门以及PQ库的活跃程度有关），但可以肯定的一点是，当QA-大量堆积时，反应中心会关闭，当QA大量存在时，反应中心会活跃。

这就是【光抑制】和【Kautsky效应】的成因，事实上就是植物的一种对于强光变换的自我保护机制。荧光强度变化的整个过程会形成一条曲线，被称为【荧光诱导动力学曲线】。注意，这里总结的电子传输路径是非常笼统形式的简单表达，关于整个光合的详细过程，建议参考这篇，写的非常详细：【Sixty-three years since Kautsky: Chlorophyll a fluorescence. 】

以上从光合作用的机理出发，揭示了荧光动力曲线的成因，荧光强度（fluorescence intensity）我们简称为F，显然F是随时间变化的，是关于时间的函数，典型的Ft曲线如下图所示，AB是同一条荧光曲线，区别在于B的横坐标刻度是对数形式。

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当 PSII 的供体侧受到伤害时，经过极短的时 间(在 J 点之前)，叶绿素荧光强度就会上升，出 现 K 点(照光后大约 300 µs 处的特征位点)，多相 荧光 O-J-I-P 变为 O-K-J-I-P(Guissé 等 1995; Strivastava和Strasser 1996; Srivastava等1997; Chen 等 2004b)，甚至有更多的拐点出现，变为 O-L-KJ-I-H-G-P (Strasser等2004)。如高温胁迫导致K点 (300 µs)出现，K 点的出现是由于水裂解系统被抑 制和QA之前受体侧的部分被抑制所造成的(Guissé 等 1995; Strasser 等 2000, 2004)。【引自论文-快速叶绿素荧光诱导动力学分析在光合作用研究中的应用】（这部分看不懂可以看1.6）

这里对F0、FJ、FI、FP、FM、FS做一个解释。【F0】也叫FO，就是在植被原始光环境中，稳定进行光合作用时散发的荧光强度；【FJ】就是植物在光环境发生变化时，快速散发荧光的一个时间节点，通常被认为发生在光环境发生变化后的大约2ms时，且被认为与QA-的大量滞留有关；【FI】则是另一个特征点，通常被认为发生在光环境发生变化后的大约60ms时，具体产生机理还有争议；【FP】则是PSII停止接受光量子后，荧光值达到的最高峰，不同的光源下，FP不同，在饱和脉冲光的照射下得到的FP就是【FM】；【FS】则是当植物在适应新光源后进入稳态后的荧光强度。

在介绍OJIP曲线的特征提取之前先回答一个问题，既然我们已经有了上面那个重要的公式（植物吸收的总光能=植物光合作用消耗的光能+k*荧光），已经说明荧光能反应光合能力，为什么还要改变植株的光环境，用荧光诱导动力学曲线去计算一些特征点呢？笔者猜测原因有几个，1.不同植株之间直接使用稳态下的Ft比较，存在个体间的差异，而荧光诱导动力学曲线能够将进行归一化计算；2.在稳态下，很多光合作用具体值通过单一的Ft是无法表达的，而改变状态，有点像设置了不同的方程，从而可以求解更多的未知量。

光谱曲线可以用VI进行特征提取，同样的，荧光动力曲线也有一些显而易见的特殊时刻的经验值，但这些经验值往往缺乏生物学意义，因此我们引出一种针对快速叶绿素荧光诱导曲线的数据析和处理方法 ——JIP测定，为深入研究光合作用原初反应提供了有力而便捷的工具。在具体介绍JIP测定之前，我们必须要先介绍能量流动模型，能量流动模型描述的是前文中所介绍的光能从被捕获到被植物用于电子传播路径中发生的各种能量损失或变化的一种简化的表达，JIP测定正是在能量流动模型基础之上，将各种能量变化进行了具体化的定量描述。

首先，能量流动模型对前文中的PSII内发生的反应结构进行了简化：

接下来介绍能量流动模型的具体过程，如下图所示：Chl吸收的所有光子通量，称为ABS；ABS一部分通量在RC中被光合作用所利用，到达RC并被利用的通量称为TR；另一部分被耗散的光子通量，称为DI，也就是ABS=TR+DI；DI中包含一部分变成荧光发散出去的通量，称为F；TR具体指使得QA被还原成为QA-的全部能量，但QA-所捕获的电子并不都能进入电子传输链路（前文中解释过滞留的原因，那两道电门），因此，能够进入电子传输链路的能量被称为ET，ET在后续反应中流入暗反应阶段，进行碳固定，这就是一个简化的能量流动模型，我们感兴趣的正是在这个能量流动过程中，各级能量的利用效率，以及能量传输的速率*，这就是JIP-测定的基础依据。（注意下图中的RC并不是一个值，而是代表单个RC的通量，例如ABS/RC代表单个RC吸收的全部ABS）

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JIP-测定涉及到的全部参数如下表所示，具体的推导过程还是相当晦涩繁琐的，建议查看论文【The fluorescence transient as a tool to characterize and screen photosynthetic samples】中的小节【Conceptual processing of data】的全部详细推导过程。但所有推导的物理量都具有较为明确的物理意义的，接下来根据笔者自己的理解用大白话对关键参数进行介绍：

【A. 一些基础参量】

【B. 代表量子效率的参量】

【C. 单位受光面积（CS）的各种量子效率的参量】

通过 JIP- 测定还可以分析光合机构的比活性，即活跃的单位反应中心(RC)或单位受光面积 (CS)的各种量子效率(ABS/RC、TRo/RC、ETo/ RC、DI o/RC、ABS/CS、TRo/CS、ETo/CS、DI o/ CS 等，表 1)以及单位面积上的反应中心的数量 (RC/CS)。比活性可以更确切地反映植物的光合器 官对光能的吸收、转化和耗散等状况。性能指数 (PIABS、PICS)包含了 3 个参数[RC/ABS (或 RC/CS)、 φPo 和 ψo]，这 3 个参数相互独立，所以性能指数 和推动力可以更准确地反映植物光合机构的状态， 它们对某些胁迫比 Fv/Fm更敏感，能更好地反映胁 迫对光合机构的影响(Appenroth 等 2001; van Heerden 等 2003, 2004)。【引自论文-快速叶绿素荧光诱导动力学分析在光合作用研究中的应用】

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既然发生光抑制的条件是植物从暗适应到强光环境的转换，那么光源的选定就变得格外重要。

调制式荧光测定方法通常使用主动荧光的方式，即测量仪器自己的光源，有两种光源，第一种高频率的【脉冲光】，第二种较为低频柔和的背景光【光化光】。

调制式荧光测定最常见的一种特征值就是NPQ，该特征值的测量遵循NPQ协议，具体的测量方法结合下图作出说明：

调制式荧光测定的最大特点就是时间采样频率很低，由于F0-Fp过程时间迅速，因此调制式荧光测定方法会漏掉这个过程中的所有细节。但本图中为了说明，并没有忽略这些细节，而是采用了完整的曲线。真实的调制式荧光测定不应当得到FI与FJ的值，同时在AL打开期间，还可以增加多次SL，本文为了说明，仅仅只提出了两次最关键的SL（暗适应下和光适应下）。

NPQ的计算公式为：NPQ = dFM / IFM – 1

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如下图所示，SL的频率为10s中一次，每一列特征点都是一条单独的SL脉冲光下的荧光动力曲线，而且在整个过程中，都有一个AL作为背景光源，同时，小图中给出了时刻为A和B的，时间刻度为对数形式的荧光动力曲线。

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相比较调制式激光测定方法，连续激发式荧光测定则还原了更高的时间分辨率和荧光动力曲线细节（也就是完整的OJIP曲线），是经常使用的一种测量方法。由于OJIP过程已经在上文中反复解释过了，因此此处不再赘述。

在前文中已经介绍了荧光动力曲线的机理、两种常用的测定方法，然而从宏观的角度上，我们仍然不知道荧光动力曲线及其特征参数，是如何与植物的具体表现（例如土壤水分胁迫、温度湿度等）所联系起来的，因此，这部分结合一些已有的文献，在前人的研究基础上进行一些总结。