基于网络药理学和分子对接法探讨柴胡疏肝散治疗功能性消化不良的作用机制

本研究以OB ≥30% 和DL ≥0.18 为依据筛选柴胡疏肝散的有效成分。同时通过TCMSP 下载有效成分对应的药物靶标。对在TCMSP 上找不到药物靶标的有效成分，利用PubChem 数据库（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ）下载其SMILES ，将获得的SMILES 导入Swiss Target Prediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/ ）中预测它们的药物靶标。然后将全部所得的药物靶标输入到UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/ ）中，设定蛋白种类为“Homo sapiens ”，将所有得到的药物靶标校正为其官方名称（official symbol ）。

1.2功能性消化不良疾病的相关靶标的收集和柴胡疏肝散治疗功能性消化不良作用靶点的筛选

利用GeneCards 数据库（https://www.GeneCardsorg/ ）、OMIM 数据库（https://www.omim.org/ ）、DisGeNET 数据库（https://www.disgenet.org/ ）和DrugBank 数据库（https://go.drugbank.com/ ）检索“functional dyspepsia ”获取功能性消化不良的相关靶点，根据Relevance score ＞1 和Score gda ＞0.05 筛选与功能性消化不良相关的靶点。然后与柴胡疏肝散有效成分的对应的药物靶点取交集，最终获得柴胡疏肝散作用于功能性消化不良的靶点，以Venn 图的形式展现交集靶点。

1.3柴胡疏肝散成分与靶点的网络构建及分析

将柴胡疏肝散有效成分信息及功能性消化不良相关靶标导入Cytoscape 3.8.0 软件，构建柴胡疏肝散成分与靶点的网络图，然后通过插件CytoNCA 分析网络的特征，计算节点的度中心性（degree centrality ，DC ），直观和准确地探索中药干预功能性消化不良的主要和次要有效成分。

1.4PPI网络的构建及分析

将柴胡疏肝散作用于功能性消化不良的靶点导入STRING version:11.0 数据库（https://string-db. org/ ），选择物种为“Homo sapiens ”，选择minimum required interactionscore 为highestconfidence 0.900 ，去除游离节点，获得蛋白互作信息。将蛋白互作信息导入Cytoscape 3.8.0 软件构建PPI 网络并进行拓扑分析，根据DC 、中介中心性（betweenness centrality ，BC ）筛选核心作用靶点。

1.5GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通过R 软件version:3.3.2 的“org.Hs.eg.db ”“DOSE ”“enrichplot ”等数据包对将柴胡疏肝散作用于功能性消化不良的靶蛋白进行基因本体（gene ontology ，GO ）功能分析，包括生物过程（biologicalprocess ，BP ）、分子功能（molecular function ，MF ）、细胞成分（cellular component ，CC ）分析，以P ＜0.05 为筛选条件，根据P 值，取排名前10 的不同生物学过程条目绘制柱状图。同时进行基因组百科全书（KEGG ）通路富集分析，以P ＜0.05 为显著富集筛选条件，得到柴胡疏肝散治疗功能性消化不良的主要作用通路。根据P 值，取排名前10 的不同生物学过程条目绘制柱状图，根据P 值，选择排名前30 的信号通路绘制柱状图。

1.6分子对接

从Protein Data Bank （https://www.rcsb.org ）中下载拓扑分析中排名前5 的核心蛋白，STAT3 （PDB ID ：6njs ）、AKT1 （PDB ID ：3qkl ）、TP53 （PDB ID ：7bwn ）、MAPK3 （PDB ID ：4qtb ）、MAPK1 （PDB ID ：4zzn ）的晶体结构。从PubChem 数据库（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ）下载了中网络图中度值排名前7 的化合物的结构，通过软件Chem3DUltra 14.0 将化合物结构转化为三维结构，并采用MM2 算法进行能量最小化处理，最小RMS 收敛参数设置为0.01 。然后使用PyMOL 软件，对这5 种靶蛋白受体进行脱水和去除有机物等处理。通过AutoDockTools 1.5.6 对靶蛋白受体分子进行加氢、计算电荷等处理，并将化合物和靶蛋白受体转换为“pdbqt ”文件，并设置合适的盒子中心以及盒子格点参数。最后，运行Vina 1.5.6 评估分子对接。通过Ligplot 软件将每个核心靶蛋白与化合物结合力最好的对接结果进行2D 图展示。

2结果

2.1柴胡疏肝散有效成分的收集及靶点预测

通过TCMSP 平台检索，以OB ≥30% ，DL ≥0.18 为标准筛选出有效成分157 个，其中陈皮5 个、柴胡17 个、川芎7 个、香附18 个、枳壳5 个、白芍13 个、甘草92 个。1 味药包含多个有效成分，同一个有效成分可以来自多味药，表明不同中药之间具有共同化合物，配伍使用具有协同增效的作用，删除有效成分中的重复项和不能在UniProt 数据库找到official symbol 的有效成分后，最终得到132 个有效成分，见表1 。通过检索TCMSP 平台和Swiss Target Prediction 数据库并且能在UniProt 数据库能成功得到official symbol 的药物靶标2 937 个，其中陈皮82 个、柴胡399 个、川芎36 个、香附428 个、枳壳103 个、白芍389 个、甘草1 500 个。删除靶点重复项后，得到个448 个药物靶点。

2.2功能性消化不良疾病的相关靶标的收集及柴胡疏肝散治疗作用靶点的筛选

通过筛选GeneCards 数据库、OMIM 数据库、DisGeNET 数据库及DrugBank 数据库的检索结果，共得到2 244 个功能性消化不良相关靶点。与柴胡疏肝散有效化合物的药物靶点取交集，最终获得233 个柴胡疏肝散作用于功能性消化不良的靶点，见图1 。

2.3柴胡疏肝散成分与靶点的网络构建及分析

通过Cytoscape 3.8.0 软件构建“中药–成分–靶点–疾病”网络图，如图2 。网络图中可以直观展示具体节点的拓扑学特征，也可以表现生物交互作用的一般特征，该图共有370 个节点和1 501 条边（128 个药物活性成分，233 个交集靶点，8 个药物名称和1 个疾病名称），表明柴胡疏肝散中有128 个有效成分作用于功能性消化不良的靶点。其中节点面积越大代表其度值（degree ）越大，节点在网络中越重要。节点之间连线表明药物有效成分与疾病靶点之间的靶向关系。

2.4PPI网络的构建及分析

将在STRING 中得到数据导入Cytoscape 软件中构建网络图，选择minimum requiredinteraction score 为highestconfidence 0.900 节点，并祛除游离节点，共祛除19 个节点，得到214 个节点和1 291 条边。利用插件CytoNCA 计算214 个靶蛋白的DC ，统计DC 中位值为10 ，选取DC20 的靶蛋白共计38 个，创建子网络，得到38 个节点和601 条边。再次利用插件CytoNCA 进行拓扑分析，计算子网络中38 个靶蛋白的BC ，统计BC 中位值为31.6 ，筛选出BC ≥31.6 的靶蛋白共计10 个，创建网络，结果如图3 ，得到10 个节点和235 条边。这10 个靶蛋白可能就是柴胡疏肝散治疗功能性消化不良的关键靶蛋白。

2.5GO功能富集分析和KEGG通路分析

利用R 软件version:3.3.2 的“org.Hs.eg.db ”“DOSE ”“enrichplot ”等数据包对柴胡疏肝散有效作用靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 通路分析。根据P ＜0.05 确定了3 371 个GO 条目，其中包括BP 3 046 个条目，CC 97 个条目，MF 228 个条目，根据P ＜0.05 ，分别取排名前10 的条目绘制柱状图进行可视化分析，如图4 所示。

进行KEGG 富集分析，结果显示P ＜0.05 ，有182 条柴胡疏肝散治疗功能性消化不良作用靶点的通路。根据P ＜0.05 ，取排名前30 条信号通路绘制柱状图，如图5 所示。

2.6分子对接

将网络图中度值排名前7 的化合物与中下载拓扑分析中排名前5 的核心蛋白进行分子对接。当结合能＜0 kJ/mol 时，认为分子蛋白质自发结合并相互作用。且结合能越低，分子构象越稳定[19] 。若结合能＜−20.92kJ/mol ，表明两者具有较好的结合性，结合力结果统计如表2 所示。分别将5 个靶点所对应结合能最高的化合物的分子对接结果进行2D 图展示，如图6 。分子对接2D 图直观展示靶蛋白受体与化合物的结合模式以及与周围氨基酸残基的相互作用。靶蛋白STAT3 、MAPK3 与槲皮素之间的主要作用力为氢键。靶蛋白AKT1 、TP53 、MAPK1 与木犀草素之间的主要作用力为氢键和疏水作用。

3 讨论

功能性消化不良的危险因素包括心理共病、急性胃肠炎、女性、吸烟、使用非甾体抗炎药物、幽门螺杆菌感染等。其病理生理学尚不完全清楚，但它可能与肠道和大脑之间的通信障碍有关，导致胃肠运动障碍、内脏超敏性、胃肠道微生物群、黏膜和免疫功能的改变[20] 。

有研究表明，柴胡疏肝散能够很好地改善功能性消化不良肝气郁结证患者临床证候，促进胃排空，降低内脏敏感性，改善胃肠激素水平，改善抑郁症状[21-23] 。柴胡疏肝散临床应用广泛，为了深入研究柴胡疏肝散治疗功能性消化不良的作用机制，本研究采用网络药理学的方法筛选出柴胡疏肝散中132 个有效成分对应448 个靶点，其中233 个靶点与功能性消化不良相关。

通过分析“中药–成分–靶点–疾病”网络图发现有128 个有效成分作用于233 个交集靶点，其中槲皮素、木犀草素、山柰酚、芍药内酯苷、芍药苷、柚皮素、川陈皮素的degree 较高，对应的靶蛋白较多，是柴胡疏肝散治疗功能性消化不良的主要有效成分。其中槲皮素具有最高的degree ，本方中的槲皮素来自柴胡、甘草、香附，槲皮素具有舒张胃肠平滑肌的作用[24] ，研究发现槲皮素可改善肠上皮细胞通透性[25] 。幽门螺杆菌感染是功能性消化不良的危险因素之一，有研究表明，槲皮素能够通过影响p38 丝裂原活化蛋白激酶、Bcl-2 和Bax 的水平以使幽门螺杆菌感染相关的细胞凋亡[26] 。木犀草素来自香附，木犀草素能抑制结肠平滑肌运动和Ca 2+ 电流，具有一定的止泻作用[27] 。有研究报道木犀草素可以抑制幽门螺杆菌的生长[28] 。山柰酚在幽门螺杆菌感染引起的炎症反应中具有抗炎作用[29] 。

精神心理因素是导致功能性消化不良的机制之一，山柰酚可显著改善慢性应激抑郁模型老年大鼠的抑郁样行为，保护神经[30] 。芍药内酯苷及芍药苷作为白芍的主要有效成分，可能通过对脑内单胺类神经递质及环核苷酸的调节作用来抵抗肝郁状态[31] 。枳壳具有促进胃肠运动的作用[32] 。陈皮能够促进小鼠胃排空和肠推进[33] ，川陈皮素是陈皮促胃肠动力的活性物质之一[34] 。白芍对结肠平滑肌有直接兴奋作用[35] 。香附通过抑制胃排空而促进肠传输[36] 。柚皮素是功能性消化不良患者口服四逆散汤剂后吸收入血的成分，能促进正常大鼠胃肠动力[37] 。

本研究通过分析PPI 核心网络结果，排名前10 位的核心靶点分别为转录激活因子3 （STAT3 ）、AKT1 、TP53 、MAPK3 、MAPK1 、PIK3CA 、SRC 、JUN 、RELA 、HSP90AA1 。STAT3 是STAT 家族的重要成员。国外有研究表明，经葡聚糖硫酸钠造模处理的小鼠，其结肠炎严重程度与活化酪氨酸激酶（JAK ）和STAT3 的过度激活密切相关[38] 。AKT 又称蛋白激酶B ，是PI3K/AKT 信号通路中的关键成员[39] 。AKT 家族主要有3 个亚型：AKT1 （PKBα ）、AKT2 （PKBβ ）和AKT3 （PKBγ ），3 者之间关系紧密，与抑制细胞凋亡、细胞增殖、细胞转移及血管生成等多个过程有关[40] 。MARK 是丝裂原活化蛋白激酶，ERK1/2 、p38 MAPK 是MAPK 信号通路的重要成员，分别具有调控细胞的生长与分化，以及调节炎症与细胞凋亡等应激反应的作用[41] 。SRC 蛋白具有促进胃癌细胞增殖、肿瘤血管生成、参与癌细胞黏附和侵袭、通过生长因子受体与生长因子相互作用共同调节肿瘤生长等作用[42] 。有研究表明，针刺能通过干预JNK 信号转导通路的主要底物c-Jun 的蛋白表达水平而发挥在急性应激下的早期抗抑郁效应[43] 。

GO 及KEGG 富集分析表明生物过程主要涉及对脂多糖、细胞对化学应激的反应、对细菌源分子的反应等；细胞成分中在膜筏、膜微结构域、膜区、小窝等靶点富集显著。分子功能中与核受体的活动、配体激活的转录因子活性、蛋白丝氨酸/ 苏氨酸激酶活性等相关性最大。进行KEGG 富集分析，其中EGFR 、PI3K-AKT 、TNF 、IL-17 信号通路等通路富集的基因较多。EGF 与动物肠道结构和功能密切相关，其具有促进肠道发育、修复受损肠道组织、影响肠道各种酶活性、提高营养物质消化吸收、抑制肠道细菌定植等作用[44] 。PI3K 是EGF 介导的最主要信号转导通路之一，AKT 是PI3K 下游靶点，能够激活和调控许多下游分子目标。柴胡疏肝散可能通过调控凋亡相关蛋白表达及PI3K/PDK1/AKT 信号通路减少由阳明腑实证引起的胃Cajal 间质细胞凋亡，从而改善胃肠功能[45] ，证实本研究有效成分和靶点分析的结果相吻合。有学者在动物模型研究中直接提出炎性细胞因子可抑制胃排空过程[46] 。有研究发现，功能性消化不良患者血清中肿瘤坏死因子-α （TNF-α ）、白细胞介素（IL ）-1β 和IL-10 水平均显著升高[47] 。另外有研究发现，IL-17F 6400A/G 基因多态性与慢性萎缩性胃炎的发生风险显著相关[48] 。

分子对接结果表明包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、芍药内酯苷、芍药苷、柚皮素和川陈皮素与核心靶蛋白STAT3 、AKT1 、TP53 、MAPK3 、MAPK1 均具有很强的结合活性，提示柴胡疏肝散可能是通过调节这些关键靶点发挥其药理作用的。

综上所述，本研究通过网络药理学和分子对接，初步阐明了柴胡疏肝散多成分、多靶点和多途径治疗功能性消化不良的作用特点。槲皮素、木犀草素、山柰酚、芍药内酯苷、芍药苷、柚皮素、川陈皮素调节大部分与功能性消化不良相关的靶点。柴胡疏肝散抗功能性消化不良通路网络中的关键靶基因为STAT3 、AKT1 、TP53 、MAPK3 、MAPK1 。柴胡疏肝散可能通过EGFR 、PI3K-AKT 、TNF 、IL-17 等信号通路促进胃排空，促胃肠动力，改善抑郁状态，减轻炎症改善患者临床证候。本研究结果可为柴胡疏肝散的进一步开发应用提供依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：王中华，赵安兰，张畇玥，赵圣轩，卓奥悉，周 畅．基于网络药理学和分子对接法探讨柴胡疏肝散治疗功能性消化不良的作用机制 [J]. 现代药物与临床, 2021, 36(9): 1794-1806 .返回搜狐，查看更多